弧菌的荧光定量pcr检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测技术领域，特别涉及一种弧菌的荧光定量PCR检测方法。
【背景技术】
[0002] 弧菌是一类广泛分布于海洋环境的嗜盐性革兰氏阴性杆菌，隶属弧菌科，弧菌属， 具有丰富的多样性。现在有10多种是水产养殖中的病原菌，包括河流弧菌、鳗弧菌、溶藻弧 菌等。河流弧菌、鳗弧菌和溶藻弧菌均为条件致病菌，当水产养殖动物在不良的环境条件 下，遭遇不利刺激或是受伤时，会诱发疾病的产生。
[0003] 随着人工养殖迅速发展，养殖水域生态变化，弧菌病已经成为海水养殖动物主要 的细菌性病害之一。具有流行广、发病率高、危害大、死亡率高等特点，给鱼、虾、蟹及贝类等 海水动物的养殖造成了巨大的影响。河流弧菌、鳗孤菌和溶藻弧菌能引起世界范围内的50 多种淡海水养殖鱼类及其它养殖动物发生弧菌病。很多研究表明，这三种弧菌是多种养殖 对虾感染发病的重要原因。可以引起对虾红腿、黄鳃、断须、额剑和尾部溃烂；对外界反应迟 钝；部分虾体发黑和肌肉白浊。河弧菌肠、溶藻弧菌还能使人治病，引起散发性腹泻。由于 弧菌是海洋环境中最常见的细菌类群之一，广布于河口海区以及海洋生物体中，同时弧菌 是一类条件致病菌，当水体环境变化，弧菌尤其是致病性弧菌繁殖迅速，如数量超过阈值则 容易引发对虾弧菌病。对弧菌引起的疾病的防治主要采取"预防为主、重点监测、防治结合" 的综合措施，有效地检测弧菌的方法将为弧菌的预防提供基本保障。
[0004] PCR检测法是检测弧菌的有效方法之一，但由于目前PCR检测的检测特异性、灵敏 度有限，当弧菌含量较低时无法及时检测出来，造成检测效率偏低、准确性不够。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明提供了一种特异性强、灵敏度高的弧菌的荧光定量PCR检测方 法。
[0006] -种弧菌的荧光定量PCR检测方法，其步骤包括：提取样本细菌培养后所得菌落 的DNA作为模板，采用特异性引物对模板进行荧光PCR扩增，所述特异性引物为以下引物对 之一：
[0007] toxR基因引物对：
[0008]上游引物toxR-F序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表SEQ ID No. 1 ;
[0009]下游引物toxR-R序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表SEQ ID No. 2 ;
[0010] f IaA基因引物对：
[0011]上游引物flaA-F序列为：TAGCGGAITTAGCAAGITCAC，即序列表SEQ ID No. 3 ;
[0012]下游引物flaA-R序列为：TGGTCATAGITTGCTCTCCT，即序列表SEQ ID No. 4 ;
[0013] pyrH基因引物对：
[0014]上游引物pyrH-F序列为：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表SEQ ID No. 5 ;
[0015]下游引物pyrH-R序列为：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表SEQ ID No. 6。
[0016] 本发明的有益效果是：由于toxR基因是弧菌的祖先基因，主要起毒力基因表达调 控的作用；弧菌的鞭毛是感染鱼类的毒力细胞器，鞭毛的纤丝是由鞭毛蛋白A，即flaA，和3 个附加的鞭毛蛋白flaB，C，D组成，其中flaA在宿主的侵袭中起着至关重要的作用；pyrH 是弧菌的主要致病基因之一，本发明分别针对toxR基因，fIaA基因和pyrH基因的设计特 异引物进行荧光PCR扩增，特异性强、灵敏度高，并可进一步确定致病菌种类为河流弧菌、 鳗弧菌或溶藻弧菌，可以检测出的最低浓度分别达到1. 0X10 6nmol/L、I. 0X10 7nmol/L、 I. 0X10snm〇l/L，检测方便快速准确，在致病菌含量较低的情况下依旧可以检出，对防止海 水养殖动物主要细菌性病害之一的弧菌病具有重要意义。
【附图说明】
[0017] 图1为实施例1荧光定量PCR扩增曲线，四条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 3nmol/L~I. 0X10 6nmol/L〇
[0018] 图2为实施例1荧光定量PCR扩增对应的熔解曲线，四条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 3nmol/L~I. 0X10 6nmol/L〇
[0019] 图3为实施例1荧光定量PCR扩增对应的标准曲线。
[0020] 图4为实施例2荧光定量PCR扩增曲线，六条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 2nmol/L~I. 0X10 7nmol/L〇
[0021] 图5为实施例2荧光定量PCR扩增对应的熔解曲线，六条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 2nmol/L~I. 0X10 7nmol/L〇
[0022] 图6为实施例2荧光定量PCR扩增对应的标准曲线。
[0023] 图7为实施例3荧光定量PCR扩增曲线，八条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 2nmol/L~I. 0X10 9nmol/L〇
[0024] 图8为实施例3荧光定量PCR扩增对应的熔解曲线，八条曲线对应的浓度依次为 I. 0X10 2nmol/L~I. 0X10 9nmol/L〇
[0025] 图9为实施例3荧光定量PCR扩增对应的标准曲线。
【具体实施方式】
[0026] 本发明提供了一种弧菌的荧光定量PCR检测方法，步骤包括：提取样本细菌培养 后所得菌落的DNA作为模板，采用特异性引物对模板进行荧光PCR扩增，所述特异性引物为 以下引物对之一：
[0027] toxR基因引物对：
[0028] 上游引物toxR-F序列为：TGCAAGTAAAGATCCTGATG，即序列表SEQIDNo. 1 ;
[0029] 下游引物toxR-R序列为：GTCGTAAACAAAATGACACAA，即序列表SEQIDNo. 2 ;
[0030] flaA基因引物对：
[0031] 上游引物flaA-F序列为：TAGCGGAITTAGCAAGITCAC，即序列表SEQIDNo. 3 ;
[0032] 下游引物flaA-R序列为：TGGTCATAGITTGCTCTCCT，即序列表SEQIDNo. 4 ;
[0033] pyrH基因引物对：
[0034] 上游引物pyrH-F序列为：AAAGAACTGGITGAACTGGGTG，即序列表SEQIDNo. 5 ;
[0035] 下游引物pyrH-R序列为：CCATCAACITTCGTCGCTTT，即序列表SEQIDNo. 6。
[0036] 优选的，所述样本细菌培养为28-37°C下振荡培养12-24h后涂琼脂平板，28-37°C 下培养12-24h。
[0037] 优选的，所述荧光PCR扩增采用20yL的反应体系，其包括：上游引物、下游引物各 0. 5-1yL，荧光染料8-12yL，模板3-5yL，无菌水余量。
[0038] 更加优选的，所述荧光染料为SYBRGreen染料。
[0039] 更加优选的，所述荧光PCR扩增的反应程序为：94-95°C预变性3min;94-95°C变性 3s，58-61°C退火 30s，40 个循环。
[0040] 优选的，所述荧光PCR扩增完成后，对扩增产物进行熔解曲线测定。PCR扩增后直 接进行熔解曲线的测定以评定反应的特异性，闭管操作避免污染，检测方便快速准确。
[0041] 更加优选的，所述熔解曲线测定方法为94-96°C15s，60°Clmin，95°C15s测定熔解 曲线。
[0042] 优选的，所述上游引物、下游引物的浓度均为9-11ymol/L。
[0043] 下面将结合实施例对本发明提供的弧菌的荧光定量PCR检测方法予以进一步说 明。
[0044] 实施例1 :采用toxR基因引物对弧菌进行荧光定量PCR检测
[0045] 本实施例按照以下主要步骤采用toxR基因引物对弧菌进行检测，并进一步进行 了灵敏度的测试：
[0046] (1)细菌特异引物制备
[0047] 在NCBI上下载河流弧菌的毒素表达调控蛋白基因toxR，引物序列通过Primer Premier5. 0进行设计，toxR基因引物对序列见表1。
[0048] 表ItoxR基因引物对
[0049]
[0050] (2)细菌培养与模板的获取
[0051] 按照无菌操作的要求挑取培养的河流弧菌单个菌落接种于5mL LB液体培养基中 置于30°C，200rpm的培养箱内振荡培养20h，直至菌液浑浊，取20yL涂布到LB琼脂平板 上，置于30°C的培养箱里培养24h。观察上述菌株的生长，选取大多数具有隆起、光滑、湿 润、圆形的菌落，以划线的方法接种于LB琼脂平板上，置于30°C的培养箱培养24h，并在4°C 环境中保存备用。所述河流弧菌来源于中华人民共和国农业部国家水生动物病原库。
[0052] (3)荧光定量PCR扩增
[0053] 利用细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司生产，提取河流弧菌的 DNA，以此DNA作为模板，进行荧光定量PCR扩增。测定DNA模板的初始浓度，根据扩增片段 大小，按照0. 66XN/C计算出配置lnmol/L的模板需要加入的初始DNA体积，其中N为引物 的长度，C为测定出的核酸浓度。为了测定反应灵敏度，进一步按照10倍梯度稀释为10 1~ 10，并分别进行了荧光定量PCR扩增。
[0054] 所述荧光定量PCR扩增采用20yL反应体系：10ymol/L的上、下游引物各 0? 5yL，SYBRGreen染料 10yL，模板 4yL，无菌水 5yL0
[0055] 所述荧光定量PCR扩增采用的PCR程序为：95°C预变性3min;95°C变性3s，60°C 退火30s，共40个循环；
[0056]反应完成后，按95. 0°C、15s，60°C、lmin，95°C、15s测定熔解曲线检测反应特异 性。
[0057] 反应所得扩增曲线如图1所示，熔解曲线如图2所示，标准曲线如图3所示。从 图1可见，采用本实施方式提供的弧菌的荧光定量PCR检测方法对河流弧菌进行检测，获得 了光滑的S型扩增曲线，灵敏度达到I.OX10 6nm〇l/L，具有良好的重复性，且溶解曲线呈梯 度，倍比稀释模板浓度和Ct值之间呈良好的线性关系，标准曲线R2X). 99,说明扩增特异性 强，效率高，且精确度高、稳定性良好。
[0058] 实施例2:采用f IaA基因引物对弧菌进行荧光定量PCR检测
[0059] 本实施例按照以下主要步骤采用flaA基因引物对对弧菌进行检测，并进一步进 行了灵敏度的测试：
[0060] (1)细菌特异引物制备
[0061] 在NCBI上下载暢弧菌的鞭毛蛋白flaA基因，引物序列通过PrimerPremier5. 0 进tx设计，flaA基因引物对序列见表2。
[0062] 表2fIaA基因引物对
[0063]
[0064] (2)细菌培养与模板的获取
[0065] 按照无菌操作的要求