本发明提供的非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法中PCR反应的 反应程序为：94°C预变性5min ;94°C变性lmin，60°C退火lmin，72°C lmin，30个循环； 72°C 8min ;4°C保持。
[0038] 本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，分别是： 检测血清型HS: 7的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 7所示；检测血清型HS: 37 的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 8所示；检测血清型HS: 21的特异性靶序列， 其核苷酸序列如SEQ ID N0. 9所示。
[0039] 上述用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，检测血清型HS:460 的特异性靶序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；检测血清型HS:550的特异性靶序 列，其氨基酸序列如SEQ ID N0. 11所示；检测血清型HS:21的特异性靶序列，其氨基酸序列 如 SEQ ID N0. 12 所示。
[0040]更进一步地，本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组 合，分别是：检测血清型HS: 7的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 13所示；检测血 清型HS: 37的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 14所示；检测血清型HS: 21的特 异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 15所示。
[0041] 本发明以病原编码CPS核苷酸遗传物质的多样性和特异性为基础，首先获得空肠 弯曲菌病原的编码CPS特异的DNA序列，再根据CPS的多样性找出各自血清型别中的特异 序列，建立了高特异度、并且重复性稳定的多重PCR的检测方法，通过识别菌株特异的DNA 序列，从而确定菌株的血清型，大大提高了高致病性菌株识别的灵敏度和特异度。利用本发 明获得的各血清型的特异序列建立的多重PCR检测方法对三种型别细菌检测的灵敏度、特 异度均为100%。本发明建立的多重PCR检测空肠弯曲菌三种血清型方法操作简单，大大降 低了检测成本以及操作难度。为防治和监测空肠弯曲菌病提供技术支持。
【附图说明】
[0042] 图1A和图1B分别为HS:7血清型的特异性引物对上下游序列与靶序列的配比情 况。
[0043] 图2A和图2B分别为HS:37血清型的特异性引物对上下游序列与靶序列的配比情 况。
[0044] 图3A和图3B分别为HS:21血清型的特异性引物对上下游序列与靶序列的配比情 况。
[0045] 图4为使用实施例2确定的3对特异性引物分别对空肠弯曲菌三种血清型进 行单重PCR检测结果，图中M:marker，泳道1:空肠弯曲菌株BJ-CJD63,（HS7)2:空肠 弯曲菌株几-(^111]1-1(批21)3 :空肠弯曲菌株耶-(：贝8-1^〇^37)4:空白对照（水）； A:HS7-1(460bp)B:HS21-1(989bp)C:HS37-2(550bp)。
[0046] 图5为本发明的三重PCR检测不同血清型的空肠弯曲菌结果；M为DL2000marker， 泳道1、2:8了-(：邛63(批 ：7)，泳道3:1?-(：贝8-1^(批：37)，泳道4:几-(^111]1-1(邯：21)
[0047] 图6A和图6B为本发明的三重PCR检测不同血清型的空肠弯曲菌 及非空肠弯曲菌的特异性实验结果，M:Marker1:链球菌，2:幽门螺杆菌， 3:结肠弯曲菌，4:BJ-CJD59(HS2)，5:BJ-CJD97(HS2)，6:HB-CJGB-QYT(HS2)， 7:BJ-CJH18 (HS2)，8:BJ-CJD55 (HS3)，9:BJ-CJD113 (HS3)，10:CJH5 (HS3)， 11:HN-06017(HS3)，12:BJ-CJD70(HS12)，13:HB-CJGB-ZB(HS19)，14:BJ-CJD101(HS19)， 15:HB-CJGB-LXC(HS19)，16:96G25(HS19)，17:HB-CJGB-ZHX(HS19)， 18 :JL-CJHLIM-1 (HS21)，19 :BJ-CJD39 (HS31)，20 :JL-CJHYIN3-1 (HS31)， 21:BJ-CJD29(HS37)，22:BJ-CJD83(HS37)，23:HB-CJGB-LL(HS37)，24:HB-CJGB-ZX(HS37)， 25:ICDCCJ07001 (HS41)，26:ICDCCJ07002 (HS41)，27:ICDCCJ07004(HS41)28:BJ-C JD120(HS1/44)，29:BJ-CJD81(HS1/44)，30:BJ-CJD106 (HS6)，31:BJ-JCD95 (HS7)， 32:BJ-CJD63 (HS7)，33:BJ-CJD131 (HS6)，34:BJ-CJD(HS6)，阳性对照：35:BJ-CJD63 (HS7) 36 :JL-CJHLIU1-1(HS12)37:HB-CJGB-LL(HS37)。
【具体实施方式】
[0048] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0049] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。 本实施例中涉及的空肠弯曲菌不同血清型不同分离株均来自中国疾病预防控制中心。
[0050] 实施例1空肠弯曲菌三种血清型特异DNA序列的确定
[0051] 本发明通过对决定菌株血清型的荚膜多糖（polysaccharide capsule，简称CPS) 合成相关基因簇的特异核苷酸序列的检测确定弯曲菌的血清型特征。对HS:7, HS:37, HS: 21三种血清型空肠弯曲菌的菌株测序，获得不同血清型菌株CPS合成相关基因簇序列，以 及区别于其它血清型的特异DNA序列，确定针对HS:7, HS:37, HS :21三种血清型菌株特异 核苷酸序列，在NCBI上进行BLAST比对，确定筛选出这些序列针对上述三种血清型菌株的 共同性以及特异性。通过比对，获得HS:7, HS:37, HS :21三种血清型菌株特有而其它血清 型菌株中不存在的三段特异序列：HS:7血清型菌株特异性序列命名为SE-HS7-1，HS :37血 清型菌株特异序列命名为SE-HS37-2, HS :21血清型菌株特异序列命名为SE-HS21-1，具体 核苷酸序列分别如SEQ ID N0. 7-9所示，其氨基酸序列分别如SEQ ID N0. 10-12所示。
[0052] Vector NTI Suite 6比对已测序HS :7, HS:37, HS :21的CPS相关基因的特异序 列的保守性。以上每个血清型的特异区域的保守性非常好，几乎没有点突变；并且在NCBI 上BLSAT上也无与其他种类菌株和空肠弯曲菌的其他任何血清型的序列有匹配，所以特异 性尚。
[0053] 实施例2引物设计与确定
[0054] 针对实施例1确定的HS :7, HS:37, HS :21这3个血清型的3条特异性靶序列，用 primer premier 5、Clone Manager 8，Oligo 7设计引物，引物设计避开序列的突变点，同 时要考虑所设计的三对引物之间以及引物与靶序列之间不错配，不出现二级结构，并且三 对引物扩增的目的片段的长度具有区别度，大小不能太接近。
[0055] 经过反复比对、筛选，最终选择针对HS:7血清型空肠弯曲菌的特异性引物对如 下，目的条带大小为460bp，核苷酸序列如SEQ ID N0. 13所示。
[0056] HS7-1F:TCCCCATCACCATAGGCTA(SEQ ID NO. 1)TM：55. 8 GC ：52. 6
[0057] HS7-1R:ACAATCCGTCTTTCGCAAT(SEQ ID NO. 2)TM ：55. 4 GC ：42. 1
[0058] HS :37血清型空肠弯曲菌的特异性引物对如下，目的条带大小为550bp，核苷酸序 列如SEQ ID N0. 14所示。
[0059] HS37-2F ：GATAAGGAAAACGGCGGTCT(SEQ ID NO. 3)Tm：58. 6 GC ：50. 0
[0060] HS37-2R ：CAAAATGGCAATCTTCAGCA(SEQ ID NO. 4)Tm ：57.1 GC ：40.0
[0061] HS :21血清型空肠弯曲菌的特异性引物对如下，目的条带大小为989bp，核苷酸序 列如SEQ ID N0. 15所示。
[0062] HS21-1F:TACTCCACGATACCGCAGG(SEQ ID NO. 5)Tm:55. 6 GC:57. 9
[0063] HS21-1R:TTATGGTTCTGCTTGGGCT(SEQ ID NO. 6)Tm:55. 6 GC:45. 5
[0064] 上述3对特异性引物与目的序列的配比情况将图1A、图1B，图2A、图2B，图3A、图 3B〇
[0065] 分别采用上述3对特异性引物对空肠弯曲