菌HS:7、HS:37、HS:21三种血清型 进行单重 PCR，反应条件为：94°C 5min ;94°C lmin，57°C lmin，72°C lmin，共 30 个循环； 72°C 8min，将扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4,结果说明分别使用3对引物的 单重PCR方法均能实现对空肠弯曲菌HS: 7、HS: 37、HS: 21三种血清型的检测。
[0066] 实施例3多重PCR检测空肠弯曲菌三种血清型方法的建立
[0067] 利用实施例2最终确定的3对引物，通过优化PCR反应体系和反应程序，确定多重 PCR检测空肠弯曲菌三种血清型的反应体系、引物序列参见实施例2,反应程序分别为：
[0068] 表1多重PCR反应体系优化结果
[0069]
[0070] 表2多重PCR反应程序：
[0071]
[0072]
[0073] 利用上述建立的多重PCR方法，分别对已知的空肠弯曲菌HS: 7、HS: 37、HS: 21三种 血清型菌株应用本实施例方法进行血清型检测，检测结果见图5,显示本实施例建立的多重 PCR方法能够实现对空肠弯曲菌HS: 7、HS: 37、HS: 21三种血清型的检测、且无交叉反应。
[0074] 实施例4本发明方法的特异度和灵敏度评价
[0075] 用无菌牙签挑取单个菌落，悬浮于100 y 1蒸馏水中，100°C 2分钟后离心，取上清。 取5 y 1作为模板按照实施例3的方法对各个血清型、各个菌种进行三重PCR。检测结果 见图6A、图6B，结果说明使用本发明实施例3的多重PCR对31株已知血清型菌株检测，只 有血清型为 HS:7, HS:37 和 HS:21 的 7 株菌（18:JL-CJHLIU1-1(HS21)，21:BJ-CJD29(HS37 )22:BJ-CJD83(HS37)23:HB-CJGB-LL(HS37)24:HB-CJGB-ZX(HS37)，31:BJ-JCD95(HS7)32:B J-CJD63(HS7))扩增结果为阳性，使用本发明实施例3建立的多重PCR方法检测空肠弯曲 菌三种血清型方法，仅血清型为7、37、21的菌株出现阳性扩增产物，且产物条带大小分别 为460bp，550bp，989bp，其它24株空肠弯曲菌其它血清型菌株以及非空肠弯曲菌的弯曲菌 属的结肠弯曲菌、链球菌以及幽门螺杆菌单菌落扩增为阴性，说明本发明方法的特异度为 100%。本次扩增的模板为单菌落，因此本实验方法的检测灵敏度为单个菌落即可鉴定，灵 敏度为100%。
[0076] 实施例5本发明检测空肠弯曲菌三种血清型7、37、21方法的临床应用
[0077] 选取来自北京、上海临床腹泻患者分离株192株，家禽、家畜来源菌株100株，共 292株不同血清型的空肠弯曲菌。
[0078] 1、利用日本生研试剂盒（Campylobacter Antisera Set (Cat270030, Lotl69026, D ENKA SEIKEN CO. , LTD,Japan ；Reagent for Preparing Sensitzed Blood Cells(Cat 271051，Lot 149031，DENKA SEIKEN CO.，LTD, Japan)进行血清分型分析，参照说明书操作 进行。
[0079] 血清型检测结果显示大部分菌株对抗血清的反应与对照血清相同，无法获得其确 切的血清型，生研血清鉴定试剂盒仅鉴定出32株血清型。
[0080] 表3 96孔板抗血清布局
[0081]
[0082] 2、采用本发明实施例3建立的多重PCR的方法进行鉴定，其中160株无法鉴定血 清型，PCR检测结果显示为阴性，而日本生研试剂盒鉴定为HS: 7, HS: 37和HS: 21的菌株，使 用本发明多重PCR方法，鉴定结果一致。说明本发明的奖惩空肠弯曲菌三种血清型的方法 具有100%的准确率。
[0083] 表4本发明方法验证32株日本生研试剂盒鉴定出结果的菌株
[0084]
[0085]
[0086] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 用于检测空肠弯曲菌（Campylobacter jejuni)三种血清型的特异性引物对组合， 其特征在于，含有以下3对引物，分别为： 用于检测血清型HS:7的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、2 所示； 用于检测血清型HS:37的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3、4 所示； 用于检测血清型HS:21的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5、6 所示。2. 权利要求1所述的特异性引物对组合在制备检测空肠弯曲菌血清型试剂盒或诊断 试剂中的应用。3. 含有权利要求1所述特异性引物对组合的试剂盒。4. 如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，其以权利要求1所述的特异性引物对组 合为引物，以待测菌DNA为模板，进行PCR，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，若电泳结果 显示目的条带为460bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS: 7 ;若电泳结果显示目的条带为 550bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS: 37 ;若电泳结果显示目的条带为989bp，则待测菌 为空肠弯曲菌血清型HS: 21。5. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，25 y I PCR反应体系为，Easy SuperMix 12. 5 y 1，CldH2O 8. 5 y 1，3对特异性引物对的上、下游引物均为0. 5 y 1，浓度均为10 yM，DNA 模板I y 1。6. 如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，PCR的反应程序为：94°C预变性5min ; 94°C 变性 lmin，60°C 退火 lmin，72°C 延伸 lmin，共 30 个循环；72°C 8min ;4°C 保持。7. -种非诊断目的的检测空肠弯曲菌三种血清型的方法，所述三种血清型为HS:7、 HS:37和HS: 21，其特征在于，同时使用3对特异性引物，通过一次PCR反应，对待测菌DNA 进行检测，若将扩增产物大小为460bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS: 7 ;若扩增产物大 小为550bp，则待测菌为空肠弯曲菌血清型HS: 37 ;若扩增产物大小为989bp，则待测菌为空 肠弯曲菌血清型HS:21 ; 所述3对特异性引物分别为： 用于检测血清型HS:7的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 1、2 所示； 用于检测血清型HS:37的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 3、4 所示； 用于检测血清型HS:21的特异性引物对，其上、下游引物核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5、6 所示。8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的反应程序为：94°C预变性 5min ;94°C 变性 lmin，60°C 退火 lmin，72°C，lmin，共 30 个循环；72°C 8min ;4°C 保持。9. 用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，其特征在于，检测血清型 HS:7的特异性靶序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 7所示；检测血清型HS:37的特异性靶 序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 8所示；检测血清型HS:21的特异性靶序列，其核苷酸序 列如SEQ ID NO. 9所示。10.用于检测空肠弯曲菌三种血清型的特异性靶序列组合，其特征在于，检测血清型 HS:7的特异性靶序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 10所示；检测血清型HS:37的特异性靶 序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 11所示；检测血清型HS:21的特异性靶序列，其氨基酸序 列如SEQ ID NO. 12所示。
【专利摘要】本发明提供了检测空肠弯曲菌三种血清型的试剂盒，属于多重PCR检测技术领域。本发明试剂盒含有三对分别针对空肠弯曲菌血清型HS:7、HS:37、HS:21的特异性引物对，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.1-2，SEQ？ID？NO.3-4，SEQ？ID？NO.5-6所示。本发明还提供了用于检测空肠弯曲菌上述三种血清型的特异性靶序列，其核苷酸序列分别如SEQ？ID？NO.7、8、9所示。本发明基于空肠弯曲菌各血清型的特异序列建立多重PCR检测试剂盒对空肠弯曲菌上述三种血清型检测灵敏度、特异度均为100％，具有检测准确，节约成本，简便快速的优点，具有良好的临床标本检测能力。
【IPC分类】C12N15/11, C12N15/31, C12Q1/04, C12Q1/68, C07K14/205
【公开号】CN105063212
【申请号】CN201510496268
【发明人】张茂俊, 梁昊
【申请人】中国疾病预防控制中心传染病预防控制所
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月13日