的表达量出1，25(011) 203处理组》5￡(：各个代数0￥?24八1 的表达量；应用的统计学方法与A-样，统计学结果显示P60-P90比P50、P30、P20的表达量 都要高（P〈〇. 05)，与其他的代数之间的表达量没有统计学的差异性；CMOSEC代数的增加 与1，25 (OH)2D3加入对CYP24A1表达量的交互作用影响结果，' + '表示两因素之间的协同作 用，'一'表示两因素之间的拮抗作用；显示P70-P90之间同时上升与下降，是值得研究的区 间，而且在P80的时候都有着明显的下降；D免疫荧光法对CYP24A1的表达的定位，P60+VD中CYP24A1在细胞核内表达，随后进入细胞核外，而1，25 (OH)2D3处理组直到PllO才进入核 内表达；
[0058] 图13是VDR在MOSEC中的表达图：
[0059] 其中，A白色柱子表示MOSEC对照组细胞VDR的表达量，柱子上面的不同形状 的符号表示先用方差分析多组比较P〈〇. 05,接着做两两之间的SNK多重比较，上面符号 一样的表示这几个代数的细胞的VDR的表达水平是在同一个档次，与其他符号的都有统 计学差异，没有任何符号的和各个组之间都没有统计学差异性；从上图可知P70 (***)的 表达量最高与其他各个代数之间有统计学差异性（P〈〇.〇5)，接下来是P80(**)比P70低 (P〈0. 05)，比其他高（P〈0. 05);接下来是P40低于P70和P80 (P〈0. 05)，但是大于其他的代 数（P〈0. 05);之后是P50和P60的表达量小于P70、P80、P40 (P〈0. 05)但是大于其他代数的 表达；然后是P20、P30、P100和P120他们的表达量最低小于P70、P80、P40、P50和P60的表 达；其中PlOO与P90与其他各个代数之间没有差异性（P>0. 05);黑色柱子表示1，25 (OH)2D3 处理组各个代数VDR的表达经过方差分析后没有意义（P>0. 05);就是各个代数的表达没 有差异性；B与之前一样对VDR也要进行交互作用的分析，GLM交互分析后发现P〈0. 05， 就说明两个因素之间存在交互作用，' + '表示协同作用，表示拮抗作用；并且显示从 P80-P120之间一直是协同作用，统计学提示这个区域值得研究；C用免疫荧光测定VDR的 表达位置图，可以看出不管是对照组还是处理组VDR的表达位置始终在细胞质，并没有发 生变化；
【具体实施方式】
[0060] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。以下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0061] 实施例1活性维生素D抑制卵巢表面上皮细胞的体外增殖能力
[0062] I. 1活性维生素D对MOSEC平板克隆形成能力的影响
[0063] 克隆形成实验或集落形成实验是测定是单个细胞长成集落的能力，可反映细胞群 体依赖性和增殖能力。为了检测1，25 (OH) 2D3对MOSEC恶性转化过程中的细胞平板克隆形成 能力是否有影响，本发明每隔10代取对照组与活性维生素D处理组细胞，比较两组细胞集 落形成能力的差异。MOSEC在体外的早期培养阶段，细胞生长极其缓慢，需要半量换液。本 实验从第20代开始（使用P20表示，以下类推）开始，使用InM的1，25 (OH) 2D3处理M0SEC， 代表活性维生素D处理组，以相同代数的MOSEC添加相同体积的乙醇为对照组，同时做平板 克隆实验，应当说明的是，活性维生素D由乙醇作为溶剂配制而成。
[0064] 对于1，25 (OH)2D3浓度的选择，如图1所示，通过不同浓度1，25 (OH) 2D3和DMBA对 MOSE细胞生长的影响，发现高浓度的1，25(0H)2D3(10nM、100nM)对于细胞本身的生长过程 影响较为显著，减缓了细胞的生长过程；浓度在InM时，MOSEC细胞保持持续增殖趋势，表 明较低浓度1，25 (OH)2D3对细胞生长有促进作用，进一步的实验证明，1，25 (OH) 2D3浓度在 0. 5~3nM时，实验结果与InM的变化不显著；因此，本实验选择InM的1，25 (OH)2D3研究其 对MOSEC细胞体外恶性转化的保护作用；另外，应当说明的是，在实际培养过程中，培养基 中1，25(0H)2D3的终浓度稳定的保持在1±0. 5nM即可，实验结果基本不受影响。
[0065] 应当说明的是，体外培养细胞与体内实验不同，只能通过添加活性维生素D以提 高活性维生素D的终浓度，而人或动物体内由于含有维生素D代谢酶系统，可以通过添加 维生素D、25-羟维生素D(25 (OH)D)或活性维生素D(1，25 (OH)2D3)以提高活性维生素D的 终浓度。本实施例及后续实施例中，若涉及动物体内实验的，可以采用添加维生素D、25-羟维生素D(25 (OH)D)的方式，也可采用直接添加活性维生素D(1，25 (OH)2D3)的方式，后续 实施例不再赘述。
[0066] 具体培养方法为：
[0067] 每隔一天换一次新鲜的培养基，倒掉一半旧的培养基，加入一半新鲜的。等到细 胞长到85%以上的时候传代，一般按照1 :2的比例传代，此期活性维生素D对细胞生长的 抑制率基本是100%，所以在20代（P20)之前没有用活性维生素D处理细胞。从20代以 后细胞的性状基本稳定，每隔一天换一次新鲜的培养基，先用PBS洗3次，再加入新鲜培养 基，同时加入1，25(0H)2D3，使其在培养基中的浓度达到InM。同时对照组加入同等体积的乙 醇。等到细胞密度达到85%以上时，对MOSEC进行传代。首先用PBS洗3次，再将0. 25% Trypsin+EDTA轻轻滴入细胞IOOmm培养皿lmL，室温Imin后用细胞培养基终止消化。细 胞悬液离心，弃上清，加入DMEM/F12完全培养基，轻轻吹打3-5次，将细胞悬液转移到新的 培养皿中培养，同时在新培养皿中的培养基中加入1，25 (OH)2D3使其终浓度达到InM(此过 程避光）。注：1，25 (OH)2D3对温度也很敏感，所以在准备加的时候才能从低温冰箱中取出 来，加完后立即放回冰箱。对照组加入同等体积的乙醇，其他操作步骤与处理组一样。此期 1，25 (OH)2D3对其的抑制率下降。这也是决定加活性维生素D处理的时间的一个重要考虑 因素。20代之前MOSEC生长速度慢、易老化、不易成活，据研究，传代时间、传代后细胞密度 将会直接影响早期MOSEC生存能力。20-30代1，25 (OH)2D3明显抑制了MOSEC的生长与对 照组相比较。30代以后两组细胞的生长速度相当。
[0068] 平板克隆形成能力测定具体方法为：分别取对数生长期的MOSEC对照组与处理组 细胞，用胰酶消化后，细胞稀释，取10y1的细胞悬液与10y1的台盼蓝混合后，吸取10y1 的混合物滴在细胞计数板上面，在细胞计数器上面计数，每组细胞分别取500个种入60mm 的细胞培养皿中，每组做3个平行样。置于37°C含有5% 0)2的培养箱中培养，培养其间不 换液，每3-5天加入新鲜培养基。14天后，倒掉培养基，用PBS洗3次，用甲基紫甲醇固定 液固定并染色3min，随后用PBS吸干净多余的甲基紫。随后放入化学发光成像系统（Gene CompanyLimitedGboxXR-5,中国香港）中用计数克隆的功能计数克隆的数目并且拍照。 在仪器中设定只计数直径大于2mm的克隆。计算克隆形成率，克隆形成率=(克隆形成数 /500)X100 %，每10代测量一次，最后以两组MOSEC代数为横坐标，克隆形成率为纵坐标绘 制线图，观察MOSEC恶性转化过程活性维生素D对MOSEC克隆形成率的影响。
[0069] 结果如图2A显示，MOSEC在P40以前不能形成克隆，之后随着MOSEC体外传代次 数的增加，1，25(0H)2D3影响了其克隆形成能力。如图2B与表1的克隆形成率的结果显示： 除了P50 (P>0. 05)外，其余各个代数的克隆形成率对照组与处理组都有统计学意义。P70代 t值是负值表明活性维生素D促进了克隆的形成率，而其他代数1，25 (OH) 2D3处理组的克隆 形成率明显低于对照组（P〈〇. 05)。如图2C与表2,克隆形成大小的结果显示：在P70以前， 两组MOSEC形成的克隆大小没有明显差异（P>0. 05)，但是，从P80开始1，25 (OH)2D3处理组 细胞的克隆直径明显大于对照组（P〈〇. 0005)。以上结果说明1，25(OH)2D3的处理影响了卵 巢表面上皮细胞的克隆形成能力。
[0070] 表1平板克隆形成率的统计处理表
[0071]
[0072] 注：MOSEC在各个代数，平板克隆形成率=(克隆形成数/500)X100%，每个样品 至少重复3次。每个代数都将对照组与处理组的克隆形成率用均数土标准差来表示。然 后用t检验做统计分析，求得对应的P值。从表中可以看出除了P50(P>0. 05)外，其余各个 代数的对照组与处理组都有统计学意义。P70代t值是负值而且P〈0. 05,可知活性维生素 D促进了克隆的形成率。
[0073] 表2平板克隆直径大小的数据处理表
[0074]
[0075] 如上表所示，两组MOSEC每个代数的克隆直径用均数土标准差来表示，单位是 (mm)，通过两组之间的t检验得出，P70以前两组之间比较的P>0. 05,克隆直径没有差异性， P80以后，活性维生素D促进了克隆的大小。
[0076] 上述统计分析过程及后续实施例采用的统计分析过程为：
[0077] 用SAS19.0进行数据的统计分析，结果用（i 表示。多组之间比较先用方差 分析，如果结果显示有差异性再用SNK法进行两两比较。单纯的两组之间的比较当统计资 料符合正态性和方差齐时，对照组与处理组之间用t检验，当统计资料符合正态性而方差 不齐时，采用校正后的t检验。当不符合正态性时采用非参数法Wiloxcon秩和检验。当 P〈0. 05时，认为存在统计学意义。
[0078] 1. 2锚着独立生长能力
[0079] L2. 1实验方法包括以下步骤：
[0080] A?准备下层胶
[0081]用双蒸水配与琼脂糖制出1.4%低熔点琼脂糖液（Agar)，高压灭菌后，置于40°C 水浴锅中平衡温度45min。同时将2X的培养基（2XDMEMF12+20%FBS)放在40°C水浴锅 中均衡温度45min。将等体积的上述两种液体混匀，以制备0. 7%Agar+(1XDMEMF12+10% FBS)。
[0082] 将I. 5ml的混合液缓缓注入35mm皿中，避免气泡产生，等待Ih以使胶完全凝固 (此过程也可将细胞培养皿置于装有冰的饭盒上面，以使下层胶更好的凝固，且不需要那么 久的时间。同时一定要保证饭盒是无菌的）
[0083] B.制备上层胶
[0084] 用双蒸水配制出0. 7%Agar，高压灭菌后，置于40°C水浴锅中平衡温度45min。将 (2XDMEM+20%FBS)在40°C水浴锅中均衡温度45min。
[0085] 消化各组细胞，台盼蓝染色后用细胞计数板计数，此实验需要细胞10, 000个/皿。 用培养基调整体积使细胞数为40, 000个/ml。
[0086] 将Iml细胞悬液加入15ml离心管中，然后加入3ml(2XDMEMF12+20%FBS)与3ml 的0.7%Agar。轻柔吹打混匀。
[0087] 在皿的底层胶的上面缓缓注入I. 5ml上述混匀液，避免气泡产生，每组设定3个平 行样。每次仅制备铺制一组细胞，以免上层胶过早凝固。置于超净台中（室温25°C)90min， 待上层胶凝固后，在上层轻轻滴入500yL培养基。
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