88] C.将皿置于37°C、5% 0)2的培养箱中培养，期间每隔3天，补加500yL培养基。 培养14天后，把平皿置于倒置显微镜下，计数>20个细胞的克隆数。每组设定3个平行样， 独立实验重复3次。
[0089] 软琼脂克隆形成率（colonyformingefficiency,CFE)=克隆形成数/接种细胞 数X100%。
[0090] 1. 2. 2实验结果如下：
[0091] 本发明实验观察了 1，25 (OH)2D3对P20-P120之间细胞的软琼脂克隆形成率的影 响，并且以人卵巢癌细胞系SK0V-3为阳性对照。如图3所示，P40以前两组的MOSEC在半 固体环境中无克隆形成，之后两组MOSEC可在软琼脂中形成直径大于15ym的克隆。在实 验中可观察到，1，25 (OH)2D3处理组MOSEC与其相对应的对照组相比较克隆直径明显减小。 通过统计学分析可以得知：P80-P90之间1，25 (OH)2D3促进软琼脂克隆的形成率（P〈0. 001)， ?50-?60，？100-?110代1，25(011)203抑制克隆的形成率（?〈0.05)。？70两组之间克隆形成 数量没有差异性是个过渡的阶段（P>〇. 05)。
[0092] 上述平板克隆、锚着独立生长能力的实验结果表明，1，25 (OH)2D3在P70以前都是 抑制MOSEC的增殖，对P70细胞的影响是一个过渡期，在P80-P90之间1，25 (OH) 2D3对MOSEC 的增殖又起到促进作用。在这之后的P100-P110, 1，25(0H)2D3抑制MOSEC的增殖。所以，本 研究根据活性维生素D对不同代数细胞增殖能力的作用不同，把P20-P120的MOSEC分为三 期，即I期M0SEC(P20-P60)、II期M0SEC(P70-P90)和III期M0SEC(P100-P120)。
[0093] 实施例2活性维生素D减弱了卵巢表面上皮细胞的体内致瘤能力
[0094] 2. 1实验方法
[0095] 实验动物
[0096] 选用SPF级免疫缺陷BALB/C小鼠，4-6周龄，饲养于12小时光照/12小时黑暗规 律的动物房，提供充足的水和饲料。SPF级BALB/C裸鼠来源于苏州大学实验动物中心。饲 养于苏州大学SPF实验动物中心，适应性饲养2周，然后剪耳、标记、分组。腹腔注射细胞后， 一周测一次体重、体温，观察小鼠一般体征，活动情况，以及肿瘤发展情况，并且做记录。
[0097] 体内成瘤实验
[0098] 裸鼠成瘤实验按照IACUC(InstitutionalAnimalCareandUseCommittee)批 准的协议执行。实验分组：DMEM/F12对照组、阳性对照SK0V-3组、P90组和P90+VD组。每 组腹腔内注射IO5个细胞。每周称体重、体温，观察腹水情况及其肿瘤的大小，裸鼠的一般 情况，接种细胞8周后麻醉处死裸鼠。
[0099] 腹水涂片与腹水细胞的培养
[0100] A腹水涂片的步骤
[0101] 分别取P90与P90+VD的MOSEC成瘤的裸鼠腹水，用无菌的一次性注射器抽取腹 水，于15ml的离心管里面离心，上层为上清液，下层为腹水细胞。取上清液于无菌的EP管 中备用。
[0102] 用移液器吸取IOiU的腹水细胞，滴到粘附载玻片上面，用另外一个干净的玻片 将载玻片上的腹水细胞均匀涂成单细胞层。随后立即用4%的甲醇固定（此过程一定要注 意不要把载玻片上面的腹水细胞吹散）然后准备染色。
[0103] B腹水细胞的培养
[0104] 将A中提及的剩余的两组腹水细胞分别种入DMEMF12培养基中（含有10%EBS)， 37°C，5% 0)2的培养箱中培养，其细胞分别取名为N90，N90+VD。
[0105] 2. 2裸鼠生存期、体重及体温的变化
[0106] 取对数生长期MOSECP90-对照组与 1，25 (OH) 2D3处理的MOSECP90 (P90+VD) -处 理组，注射IO5个细胞于裸鼠腹腔，人卵巢癌细胞系SK0V-3为阳性对照组，DMEM/F12培养 基组为阴性对照。如图4A所示，是裸鼠的体重随着时间的变化而变化的趋势，与培养基对 照相比较，MOSECP90、P90+VD和阳性对照SK0V-3的裸鼠体重随着时间增加逐渐增高，P90 组在第5周后体重最高，这可能与这组裸鼠腹腔腹水形成较多有关。P90+VD与SK0V-3的 体重变化基本同步，而且没有差异性，可能是由于他们的成瘤情况相近。在第8周时，P90、 P90+VD和SK0V-3的体重增加明显（增加IOg左右），对成瘤情况的观察可知，在7-8周之 间，腹水一周内迅速增加，可能是腹水增加导致体重增加的缘故。裸鼠的体温变化基本处于 一个平稳的趋势，但是在第7周的时候P90与P90+VD体温突然升高，第8周成瘤时，体温平 稳，而此时SK0V-3裸鼠体温升高。因为此组裸鼠活动明显减少，而且成瘤裸鼠体温偏高（图 4B)。由于部分裸鼠一般状况较差，腹水已经很明显，因此观察至第8周时处死裸鼠。在致 瘤实验观察期，未发现各组裸鼠生存期的改变。
[0107] 2. 3腹腔注射观察致瘤性
[0108] 裸鼠在接种P90和P90+VD细胞后7周时，腹部明开始膨胀，但是不明显，且皮肤 呈青紫色，体表未触及肿块，运动减少，精神不佳，疑似形成腹水，在第8周时，腹部增大很 明显，腹膜血管清晰可见，且小鼠消瘦。解剖后发现，P90组小鼠腹腔内约有13ml血性腹 水，P90+VD组约4ml，随后将腹水细胞分离培养，发现种植P90对照组细胞的裸鼠腹水细胞 (N90)生长很快，且形成很多恶性转化灶，相比之下接种活性维生素D处理组细胞P90+VD的 裸鼠腹水细胞（N90+VD)生长缓慢，且形状规则（如图5G)。用裸鼠体内形成的腹水细胞涂片 后，HE染色发现腹水中主要是淋巴细胞和红细胞，N90细胞出现多核，不规则的肿瘤细胞， N90+VD在镜下并没有发现异形核的肿瘤细胞（如图5F)。腹腔内肠系膜出现大量转移灶， P90的裸鼠（图5B)腹腔的肠系膜转移成葡萄状，表面光滑，透亮，触及较硬，数量很多，无法 计数，重量共5. 1561g(见图OT)。再重复进行两次实验，结果分别为：4. 9689g和4. 6231g。 相比之下P90+VD注射的裸鼠转移较少，肠系膜转移共I. 2335g(如图5E)，再重复进行两次 实验，结果分别为：〇. 9829和2. 1349。将转移的组织做石蜡切片，HE染色后发现，P90在 裸鼠体内形成的肿瘤组织细胞大小不一，细胞核不规则，核浆比大，组织中有血管形成，而 P90+VD组的肿瘤组织了没有血管形成，也有不规则的肿瘤细胞，但是与P90组相比较数量 较少（见图5H)。以上结果说明，1，25 (OH) 2D3虽然不能完全抑制P90的MOSEC成瘤性，但是 可以减弱其成瘤能力。具体表现为：使其肿瘤转移灶减少，腹水细胞中的肿瘤细胞减少，腹 水形成量减少。
[0109] 2. 4活性维生素D抑制裸鼠腹水细胞的间质性状
[0110] 为了进一步研究MOSECP90对照组与P90+VD活性维生素D处理组细胞接种裸鼠 后形成腹水细胞（分别使用N90与N90+VD表达）的性状差异，选择P90、N90以及P90+VD 和N90+VD四组细胞，通过提取四组细胞的RNA做实时荧光定量PCR，检测间质细胞标志因子 N-cadherin、EMT转化因子Snail和0 -cantenin、基质金属蛋白酶3(MMP3)以及与维生素 D代谢相关基因CYP24A1的表达，从而全方位的分析这四组细胞之间的差异性。
[0111] 实验方法为：
[0112] A提取细胞RNA
[0113]分别收集MOSECP90、P90+VD、N90 和N90+VD的细胞，加入ImL的trizol，Imin后 用移液器轻轻的吹打细胞悬液混匀，而后移入一个干净的不含DNA、RNA酶的I. 5ml的EP管 里面，在室温下静置5min，在装入裂解物的离心管里面加入0. 2ml的氯仿（为Trizol总体 积的1/5)震荡混匀15s，室温下静置2-3min。离心12000rpm，15min，4°C。分为三层液相， 最上面一层是RNA，Iml的裂解物产生的上清液为0. 4-0. 5ml。小心用移液器吸取上清液， 移入到另一个EP管里面。在上清液中加入0. 5ml的100%异丙醇，震荡混匀30s，室温静置 lOmin，随后离心12000rpm，lOmin，4°C，此时RNA沉淀将来离心管底的侧面形成，小心吸取 上清液避免触及底部的RNA沉淀，离心管加入75 %预冷的乙醇震荡混匀30s，离心7500rpm， 5min，4°C，重复以上清洗3次后，干燥RNA，加入DEPC水，检测浓度与纯度，备用。
[0114] B逆转录为cDNA
[0115]取RNA2yg并且参照TranscriptorFirstStrandcNDASynthesisKit(roche 公司）的逆转录试剂盒的说明对RNA逆转录。逆转录反应条件为：37°C60min，85°C5min。
[0116] CPCR
[0117] 逆转录获得的cDNA稀释5倍后进行RT-PCR反应。RT-PCR的体系使用20yI，SYBR Green10y1，CDNA2y1，上下游引物分别I. 5y1，水5y1。反应体系参照SYBRGreenI NucleicAcidGelStain的说明书，反应条件为：95°C10min，95°C10s，60°C20s，72°C30s， 45个循环。所有反应均设3个复孔。记录每个反应管中样品的CT值，实验结果采用相对定 量法AACT进行分析，以2-AACT表示1，25-(OH) 2D3处理组表达量相对于对照组表达 量的变化倍数。内参选用P-actin。
[0118] 结果如图6所示：N90细胞基因N-cadherin，MMP3和CYP24A1表达量都高于其他 三组（P〈0. 05)，Snail和P-catenin的表达四组之间没有差异性。P90+VD组CYP24A1的 表达高于P90与N90+VD组，并且低于N90组细胞。以上实验结果说明接种对照组细胞后形 成腹水细胞的间质性较强，而且恶性程度也较高，而活性维生素D可以抑制了腹水细胞的 恶性程度。
[0119] 实施例3活性维生素D抑制卵巢表面上皮细胞的体外迀移能力
[0120] 为了观察1，25(0H)2D3是否在长期处理过程中抑制MOSEC的迀移能力，本发明使用 Transwell与划痕实验来检测MOSEC的迀移能力。实验方法如下：
[0121] Transwell迁移实验
[0122] 应用微滤膜培养小室，来检验MOSEC的迀移能力，以及活性维生素D的长期处理的 对迀移能力的影响。滤膜上面有8ym的微孔可允许细胞穿过到达膜下面，这些穿过去的细 胞可粘附于膜下面，通过粘附细胞的数量来反映迀移情况。具体的实验步骤：分别对两组 MOSEC于实验前一天进行饥饿处理，第二天消化饥饿处理过的细胞，计数，分别取1000个细 胞溶于700y1无血清的DMEM/F12培养基中。种入小室内，小室放入24孔板孔中，24孔板 中加入Iml放入含有10%的FBS的DMEM/F12。注意小室底部与24孔板培养基之间不能有 气泡。随后放入37度，5%C02的培养箱培养12h。然后取出小室，用PBS洗后，用4%的甲 醇固定3min，后用PBS洗3次，甲基紫染色3min后，再用PBS洗后，在显微镜下拍照。随后 在24孔板中加入100 %的乙醇，将小室放入其中，在摇床上摇lOmin，随后酶标仪检测450nm 处各孔处吸光度值（A)。迀移实验至少重复3次。
[0123] 细胞划痕实验