>[0124] 取对数生长期的各组细胞，消化制成单细胞悬液，台盼蓝与细胞计数板在细胞计 数器上面染色计数数后，取5XIO5个细胞接种于35mm培养皿中，12h贴壁后。换用无FBS 的培养基继续培养24h。使用100yL的枪头在细胞单层面划过，用预温的PBS轻轻漂洗4 次洗去细胞碎肩，以形成一个无细胞区域的条带。用含10%FBS的培养基继续培养细胞，于 划痕后的他，1211，2411，481 1在显微镜下（40\)观察拍照并测量宽度。各组选取3个不同的 位置，利用以下公式计算分析细胞迀移能力。每组设定3个平行样，独立实验重复3次。迀 移指数（migrationindex，％)=(初始划痕宽度-愈合后划痕宽度）/初始划痕宽度。
[0125] 结果显示：在MOSEC自发恶性转化过程中，虽然1，25 (OH)2D3对P60、P70的MOSEC 的迀移能力没有影响（P>〇. 05)，但是对其余各代数都是抑制MOSEC的迀移（图7A1和图 7A2)。接着用划痕实验来验证Transwell实验结果，选取P40的两组M0SEC，分别在划痕后 12h，24h，48h测量划痕愈合能力，结果如图7B1和7B2所示。统计分析后发现，1，25 (OH) 2D3 抑制了MOSECP40三个时间点的划痕愈合能力（P〈0. 05)。以上实验结果表明活性维生素D 可以抑制卵巢表面上皮细胞的迀移能力。
[0126] 实施例4活性维生素D增强II期卵巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性
[0127] 本发明用10nM，50nM和IOOnM的紫杉醇分别处理M0SECP90与M0SECP90+VD细胞， 48h后检测紫杉醇对细胞生长的抑制作用。具体实验方法如下：
[0128] A制备细胞
[0129] 分别取对数生长期的MOSECP90对照组与1，25 (OH) 2D3处理组细胞，消化后计数 取2XIO3个细胞接种于96孔板的一个孔，一个样品接种需要种36个孔（因为一个化疗药 物剂量组需要6个重复）。需要种3个板（每个时间点需要重复测量）
[0130] B实验条件
[0131] 置37°C，5%C02培养箱培养过夜，待细胞贴壁后弃去培养基，用PBS洗3遍，然后 加入含不同浓度Taxol的培养基200y1，同时对照组加入同体积的含有无水乙醇的10%胎 牛血清DMEM/F12培养基；实验组培养基中加入不同浓度Taxol(10, 50,IOOnM)。每组设六个 复孔。将细胞置培养箱培养48h后吸掉培养基。然后加100y1新鲜培养基和10yICCK-8 检测液，37°C孵育lh，酶标仪检测450nm处各孔处吸光度值（A)，从而来说明对照组与处理 组的MOSEC对抗癌药物的敏感性差异。
[0132] 结果如图8,随着紫杉醇浓度的增加，对照组和维生素D处理组MOSEC的存活率都 有下降的趋势，并且在50nM浓度时，紫杉醇对细胞活力的影响最大。同时发现在同一个浓 度下，1，25 (OH)2D3处理组MOSEC的细胞存活率明显低于对照组（P〈0. 05)。实验结果说明紫 杉醇可以抑制恶性转化的卵巢表面上皮细胞生长，并且活性维生素D增强了恶性转化的卵 巢表面上皮细胞对紫杉醇的敏感性。
[0133] 实施例5维生素D减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的机制
[0134] 5. 1活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化过程与调控EMT有关
[0135] (1)细胞形态的改变：体外长期连续培养过程中，对照组MOSEC由上皮细胞的"鹅 卵石形"转化成间质细胞样的"纺锤梭形"。活性维生素D在I、111期抑制这种转化进程，而 在II期却促进了此进程。
[0136] (2)EMT标志蛋白的表达：Western-blotting的实验结果如图9所示，随着MOSEC 体外恶性转化过程，活性维生素D抑制了EMT相关蛋白N-cadherin、Snail和0-catenin 的表达，促进了E-cadherin的表达。免疫荧光与此一致，同时还显示活性维生素D抑制了 0 -catenin向核内转移。说明活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程与调控 EMT标志蛋白有关。
[0137] ⑶EMT相关基因的表达：如图10所示，在MOSEC的I期，活性维生素D促进了 MMP3、ESRl的表达，抑制了SPPl的表达，对C0L3A1的没影响，说明活性维生素D通过下调 SPP1、上调ESRl来抑制I期细胞的EMT进程。在II期，活性维生素D促进了SPP1、C0L3A1 的表达，抑制了MMP3与ESRl的表达。说明活性维生素D在此期通过下调MMP3抑制EMT，通 过上调SPPUC0L3A1与下调ESRl的表达促进细胞的增殖能力。在III期，活性维生素D通过 下调SPPl和MMP3、上调ESRl抑制III期细胞的EMT。以上实验结果说明在卵巢表面上皮 细胞恶性转化的不同阶段，活性维生素D调控的EMT相关基因也不同，这可能是它对不同阶 段细胞增殖能力影响不同的原因之一。
[0138] 5. 2活性维生素D减缓卵巢表面上皮细胞的恶性转化与维生素D代谢关键酶的变 化有关
[0139] 如图11至13所示，Real-timeQ-PCR的实验结果显示，在MOSEC的自发恶性转 化过程中，对照组中活性维生素D合成基因CYP27B1、失活基因CYP24A1与维生素D受体(VitaminDRec印tor，VDR)的表达都呈现一个正态分布曲线的趋势，并且在II期细胞P70 时达到最大值。活性维生素D处理刺激了每一个代数细胞中CYP24A1的表达剧增（P〈0. 05)， 最高者达到了 15000倍。但是处理组CYP24A1增长的幅度不同，P60和P90的表达量明显高 于其他代数，也就是说CYP24A在II期细胞的表达比I和III期高。同时实验发现处理组II期 细胞CYP27B1与VDR的表达下降，结合此期相对较高表达的CYP24A1的结果，说明II期活 性维生素D的有效作用量减少。与同一代数对照组的MOSEC比较，I期处理组细胞CYP27B1 与VDR的表达升高，与此期相对较低表达的CYP24A1的结果结合分析，说明I期活性维生素 D的有效作用量增加。同理，III期细胞CYP27A1与VDR的表达没有变化，而CYP24A1的表达 相对较低结合发现，说明III期活性维生素D的有效作用量增加。研究还表明，CYP24A1抑 制剂与骨化三醇即活性维生素D联合给药增强了活性维生素D的抗肿瘤细胞增殖作用，并 且提高全身活性维生素D利用率，促进胱天蛋白酶独立凋亡通路的激活。以上实验结果说 明，在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段，虽然加入同样浓度的活性维生素D干预，但 是由于维生素D代谢酶和VDR表达的变化，导致每一阶段活性维生素D的有效作用量不同， 对细胞增殖能力的影响也不同。
[0140] 综上所述：在MOSEC恶性转化的I期，由于1，25 (OH)2D3合成基因CYP27B1表达上 升，降解基因CYP24A1表达下降，从而使得活性维生素D在I期的有效作用量增加，而且此 期VDR也是高表达的一个状态，所以1，25(0H)2D3很好地发挥了生物学效应，通过上调上皮 细胞标志物E-cadherin、下调间质细胞标志物N-cadherin、EMT转录因子0 -catenin和 Snail等的表达抑制了I期细胞的EMT进程，同时增加ESRl的表达，减少SPPl的表达。使 得在此期1，25 (OH) 2D3抑制细胞的增值和迀移能力的可能机制。
[0141] 在MOSECII期，1，25(0H)2D3的长期处理诱导CYP24A1的表达持续上升了近15000 倍，降解1，25 (OH)2D3使其失活，1，25 (OH) 2D3的失活又负反馈性调节合成基因CYP27B1的表 达上升，但是其上升的倍数远低于降解基因CYP24A1的上升幅度。所以此期1，25(0H)2D3的 有效作用量实际是下降的，而且受体VDR的表达量也同时下降，这就使得活性维生素D对 MOSEC的效应减低，这也是1，25 (OH)2D3促进II期细胞增值能力的主要原因。当然在II期， 1，25 (OH)2D3也表现出抑制MOSEC的EMT进程，下调MMP3的表达，，并且抑制了体外细胞的 迀移能力和体内的致瘤能力和转移能力，增强了细胞对紫杉醇的敏感性。
[0142] 在MOSEC的III期，1，25 (OH)2D3合成基因CYP27B1的表达没有变化，但是降解基因 CYP24A1的表达下降，而且VDR的表达没有变化，从而使得1，25 (OH)2D3的有效作用量上升。 因此，此期的1，25 (OH)2D3同样抑制了MOSEC的EMT进程，上调ESRl、下调SPPl和MMP3的 表达，。所以1，25 (OH)2D3对III期MOSEC的增殖和迀移能力均表现为抑制作用。
[0143] 以上实验结果说明，在卵巢表面上皮细胞恶性转化的不同阶段，虽然加入同样浓 度的活性维生素D干预，但是由于维生素D代谢酶和VDR表达的变化，导致每一阶段活性维 生素D的有效作用量不同，对细胞增殖能力的影响也不同。
[0144] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和 变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，其特征在于：卵巢表面上皮细胞恶性 转化过程中，每次传代及每次更换培养基时添加活性维生素D。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中， 所使用的培养基中添加活性维生素D、并使其终浓度维持在0. 5~3nM。3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于：减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化，所使用 的活性维生素D的终浓度维持在1 ±0. 5nM。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：培养过程中，在-30~-20°C环境下添加 活性维生素D。5. 维生素D在制备减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的试剂上的应用，其特征在于：所 述维生素D为包括维生素D2、维生素D 3、维生素D类似物、25 -羟维生素D、以及活性维生素 D在内的一种或多种。6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述维生素D选用活性维生素D。7. 维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，其特征在于：所述维生素D为包括维生 素D2、维生素D3、维生素D类似物、25 -羟维生素D、以及活性维生素D在内的一种或多种。8. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述维生素D为活性维生素D。9. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述药物包括维生素D及化疗药物，所述 化疗药物包括紫杉醇。10. 根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述卵巢癌为起源于卵巢表面上皮细胞 的上皮型卵巢癌。
【专利摘要】本发明涉及一种减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的方法，卵巢表面上皮细胞恶性转化过程中，通过每次传代以及每次更换培养基后添加活性维生素D(1,25(OH)2D3)，以达到减缓卵巢表面上皮细胞恶性转化的目的；本发明还提供维生素D在制备治疗卵巢癌药物上的应用，通过长期使用低剂量的维生素D、25–羟维生素D或活性维生素D，可以有效减弱卵巢表面上皮细胞在裸鼠体内的致瘤能力。
【IPC分类】A61K31/593, A61K31/592, A61P35/00, A61K31/59, C12N5/071
【公开号】CN105087463
【申请号】CN201510495988
【发明人】李冰燕, 王萍, 张鹤美, 张增利, 刘利芝, 侯永凤, 胡志勇
【申请人】苏州大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月13日