GCTAC-MGBNFQ-3'（探针；SEQ ID NO :6)。用于 頂PDH2的引物探针组被设计成包含外显子10和11并且产生74bp的PCR产物： 5' -CCACAGTCATGATGGGCTCTC-3'（正向；SEQ ID N0:7) ;5' -GGATCCCATCGGAAAAGAAGTA(反 向；SEQ ID NO :8) ;5' -6FAM?-ACCACTGAGGCCCCT-MGBNFQ-3'（探针 SEQ ID NO :9)。用 于PSA的引物探针组产生67bp的PCR产物：5' -CCACTGCATCAGGAACAAAAG-3'（正向； SEQ ID NO :10) ;5-TGTGTCTTCAGGATGAAACAGG-3'（反向；SEQ ID NO : 11) ;5' - VIC⑩ -CGTGATCTTGCTGGGT-MGBNNFQ(探针；SEQ ID N0:12)。B2M 和 GAPDH mRNA 转录产物作为对 照测定并且作为预开发TaqMan⑧测定试剂（Applied Biosystems)购买。人前列腺癌细胞 (CRL-2505)用于提供阳性对照的RNA(ATCC)并且用QIAamp RNA血液微型试剂盒（Qiagen， Hilden，Germany)提取。阴性对照从First Choice?人前列腺总 RNA (Applied Biosystems) 获得。
[0104] 实施例2-结果
[0105]患者特征。患有活检证实的前列腺癌和BPH的患者具有相似的年龄（中值分别是 66对比63) (p = 0. 21)(表1)。人种分布也是相似的，大多数患者是白种人（表1)。然而， 正如所料在两个组的血清PSA之间有显著差异（p < 0. 001)，其中BPH组的中值为4. 4ng/ ml，癌症组的中值为5. 7ng/ml (表1)。因为对照数据和样本是在20名前列腺癌前列腺切除 术之后的患者上收集的。如表1所示，这组患者具有相似的年龄和种族背景，但是PSA同样 显著地比BPH和癌症组更低（中值为0.0 lng/ml)。癌症患者和前列腺切除术后患者之间的 Gleason组织分级相似。Gleason分级是根据基于2005共识会议的新改良的系统完成的。
[0106]前列腺切除术后以及癌症和BPH患者之间的显著差异。在单变量分析中，在前列 腺切除术后患者以及癌症组之间，尿液中的roUM5(p = 0. 005)、UAP1(P= 0. 001)、PCA3(p < 0.0001)、TMPRSS(p = 0.009)和血浆中的 HSPD(p = 0.01)、頂PDH2(p = 0.003)、UAPl(p =0? 02)和 ERG(p = 0? 02)有显著的（p < 0? 05)差异。
[0107]前列腺切除术后和BPH的尿液中的HSPDl (p = 0. 004)、頂PDH2 (p = 0. 002)、 PDLMI5 (p = 0? 0003)、UAPl (p = 0? 0003)、PCA3 (p <0? 0001)、TMPRSS 和（p = 0? 0006)以 及血浆中的HSPD(p = 0. 006)、頂PDH2(p = 0. 002)、UAPl(p = 0. 03)之间有显著差异。这 清楚地显示大部分这些标记物是前列腺特异性的并且这反映在血浆样本以及尿液样本中。
[0108]伸用单夺量比较的BPH和前列腺癌之间的边际差异。在单夺量分析中，BPH和前 列腺癌之间只在尿液中的HSroi(P= 0? 05)、頂PDH2(p = 0? 01)、roUM5(p=0? 05)和血浆 中的Erg(p = 0? 0003)中有显著差异。
[0109] 除了血浆ERG表达之外，BPH和癌症之间的差异极小，这反映出辨别两种病状中的 困难并且很可能是由于患有癌症的大部分患者还患有BPH的事实。
[0110] 多变量分析以及K分BPH与癌症的算法的开发。为了能够使患有前列腺癌的患者 与BPH患者区分并且同时利用尽可能多的变量，但是还除去不相关的变量，发明人研究了 数学算法的价值。发明人首先将样本分到学习（训练）组和测试组中，前者包括70名患 者（35名癌症患者和35名BPH患者），后者包括51名患者（26名癌症患者和25名BPH患 者）。此外，在使用测试51名患者组验证模型之前，还使用了训练组，其中大约三分之二用 于建立模型，三分之一用于测试。开发算法中包括的变量是UAP1、H)UM5、頂PDH2、HSroi、 PCA3、PSA、TMPRSS2、ERG、GAPDH、B2M、年龄和血清 PSA。
[0111] 发明人使用了多种数学算法来选择特征并且比较了各种算法之间的平均AUC 和平均误差率。所有使用的算法都基于机器学习并且包括逻辑回归、SVM(支持向量 机（Support vector machine))、Lasso(最小绝对收缩和选择算法（least absolute shrinkage and selection operator))、boosting、bagging、随机森林、CART(分类和回归 树（classification and regression tree))、matt 和 ctree (条件干涉树（conditional interference tree))。如表2和图I所示，来自所有算法的最好的AUC和最小的误差率是 通过逻辑回归获得的。在这个训练组的算法测试中显示出0. 77的AUC和0. 27的平均误差 率。在这个模型中，包括六个变量并且每个变量的贡献显示在图1中。特征消除用于消除 不利于改善模型的变量。这个模型中包括的六个变量是血浆ERG、血清PSA、尿液PCA3、尿液 MPDH2、尿液 PDUM5 和尿液 HSPDl。
[0112] 当对测试组应用相同模型时，获得相似的结果（图2)。对于逻辑回归，发明人获得 这个组的平均AUC值为0. 78。当考虑所有121个样本并且每个组测试100次每次选择随机 样本时，发明人获得的AUC在0. 70和0. 85之间变化。逻辑回归算法显示分界点为0. 565 (图 3)最小误差率为0.25。在这个分界点，特异性和灵敏度分别在88%和67%。
[0113] 在这组患者中单独使用血清PSA并且分界点为4,特异性为62%并且灵敏度为 56%。使用sPSA分界点> 14. 1，我们获得100 %特异性但是灵敏度为18%。
[0114]多夺量分析和冈分停袭件前列腺癌的筧法的开发。已经表明在改讲的Gleason评 分系统中评分< 7是进展缓慢癌症并且所述癌症的死亡风险非常小。在前列腺癌Gleason 评分< 6的患者中，无论是否治疗，诊断后10至15年内死亡的风险是相同的（Carter等， JC0, 2012年12月10日）。因此，我们集中了 Gleason < 7的患者以及患有BPH的患者并 且研究了我们的生物标记物在从其余的患者（Gleason < 7和BPH) (89名患者）中预测 Gleason彡7(32名患者）的前列腺癌患者的潜力。
[0115] 将全部数据集随机分配到训练（69名患者）中，包括18名患有侵袭性癌症的患者 和51名患有BPH/Gleason < 7的患者。测试组（52名患者）包括14名患有侵袭性癌症的 患者和38名患有BPH/Gleason < 7的患者。
[0116] 数学模型是使用训练组以如上所述的相同方式建立并且比较了 AUC和误差率。图 4显示每种算法的平均AUC和误差率。此外，基于随机选择之后100次测试，逻辑回归在训 练组中以0. 87的平均AUC证明是提供信息最多的模型。测试组显示0. 88的AUC。当组合 并且测试全部样本时，AUC是0.88。在这个模型中，四个变量足以开发这个算法，并且这包 括血清PSA、血浆UPAl、血浆ERG和尿液PDCHM5，如图4所示。这些变量每个的贡献在图4C 中显示。
[0117] 根据AUC，我们选择0. 61作为分界点，它给出0. 99的特异性和0. 47的灵敏度（表 3) 〇
[0118] 晚期癌症的数目相对较小（32名患者），然而，0. 87的AUC值在一个标准偏差之 内。基于50个迭代测试，平均值± ISD是0. 73至0. 92。
[0119]从患有讲展缓慢癌症或BPH患者检测患有停袭件癌症患者的组合樽铟。h沭两种 模型使用不同变量和不同算法，它们完全独立。当使用两个模型评价个体患者时，通过两个 模型获得一致的结果很可能表示更强的预测。为了研究这个，发明人使用全部121名患者 比较了两个模型之间的结果。在121名患者中，91名（75%)具有一致的结果。在这组患者 中，预测侵袭性癌症对比进展缓慢癌症或BPH中的特异性和灵敏度分别是99%和68% (表 4,图6)。其余患者（总数的25%)具有不一致的结果，并且由于实际原因应该只在特异性 和灵敏度为88 %和67 %的存在或不存在前列腺癌的预测中考虑，但是不能针对癌症的侵 袭性可靠地分类。
[0120] 表1.研究中使用的患者的特征。
[0122] 表2.使用训练组通过用来区分癌症和BPH的各种数学算法获取的AUC和误差率。
[0124]表3.用于区分侵袭性前列腺癌与BPH/进展缓慢的前列腺癌平均AUC和标准偏 差。
[0127] 表4.所述三种算法的灵敏度、特异性、阳性预测值（PPV)和阴性预测值（NPV)。
[0128]
[0129] 实施例3-使用额外的标记物的测定
[0130] 材料和方法
[0131] 研究设计和患者
[0132] 从来自四个泌尿科实践的呈现前列腺肿大并且预定前列腺活检的287名男性收 集尿液和血液样本。用于活检的肿瘤的组织GS证实PCa是由每个患者的部位提供的。 Gleason分级根据基于2005共识会议的新修改的系统进行（Epstein等，2006,以引用方 式并入本文。）活检显示103名（36% )患者患有BPH并且184名（64% )患者患有PCa。 107名PCa患者在高风险组（PCa的58 %以及总数的37 % )中。排除接收BPH或PCa的任 何疗法的患者并且为了参与所述研究需要患者是新确诊的。尿液样本在没有数字化直肠检 查（DRE)的情况下收集的并且在收集48小时内处理。所有患者提供9mL在乙二胺四乙酸 (EDTA)中的外周血液。没有其他选择标准，样本表示普通患者。所有实验室工作都在IRB 批准的流程（Western IRP)下进行。
[0133] 尿液和血浆处理
[0134] 通过在浮桶式转头中在4,OOOxg下使用具有3KDa膜的Amcion Ultra-15离心 过滤机单元（Millipore，Billerica，MA)离心将来自每个患者的净排尿液浓缩到Iml的体 积。使用标准离心将血衆与外周血液分离。使用NucliSENS?提取试剂盒（BioMerieux， Durham，NC)从浓缩尿液或血浆中提取总核酸。
[0135] 定量逆转录-聚合酶链式反应（qRT-PCR)
[0136] 定量逆转录-实时聚合酶链式反应（qRT-PCR)在ViiA? 7实时PCR系统 (Applied Biosystems)上使用 RNA 超敏一步定量 RT-PCR 系统（Applied Biosystems， Foster City，CA)进行，其中热循环条件如下：50 °C持续15min的保持阶段，95 °C持续 2min，随后95°C持续15秒和60°C持续30秒的45个循环。从First Choice?人前列腺 总 RNA(Applied Biosystems)获得六点连续稀释标准物。PDLIM5、PCA3、TMPRSS2、ERG 和 PTEN 引物和探针作为分别具有测定号 Hs00935062_ml、Hs01371939_gl、HsOl 120965_ml、 Hs01554629_ml 和 Hs01920652_sl 的 TaqMan 基因表达测定（Applied Biosystems)购买。 用于UAPl的引物探针组产生70bp的PCR产物：5' -TTGCAITCAGAAAGGAGCAGACT-3'（正 向；SEQ ID N0:1) ;5'-CAACTGGTTCTGTAGGGTTCGTTT-3'（反向；SEQ ID NO: 2)和 VIC⑩-TGGAGCAAAGGTGGTAGA-MGBNFQ (探针；SEQ ID NO :3)。用于 HSPDl 的引物探针组产生64bp的PCR产物：5' -AACCTGTGACCACCCCTGAA-3'（正 向；SEQ ID N0:4) ;5'-TCTTTGTCTCCGTTTGCAGAAA-3'（反向；SEQ ID N0:5); VIC? -ATTGCACAGGTTGCTAC-MGBNFQ(探针；SEQ ID NO :6)。 用于 IMPDH2 的 引物探针组被设计成包含外显子10和11并且产生74bp的PCR产物： 5' -CCACAGTCATGATGGGCTCTC-3'（正向；SEQ ID N0:7) ;5' -GGATCCCATCGGAAAAGAAGTA(反 向；SEQ ID NO :8) ;6FAM ?-ACCACTGAGGCCCCT-MGBNFQ(探针；SEQ ID NO :9)。用于 PSA 的引物探针组产生 67bp 的 PCR 产物：5' -CCACTGCATCAGGAACAAAAG-3'（正向； SEQ ID N0:10) ;5'-TGTGTCTTCAGGATGAAACAGG-3'（反向；SEQ ID N0:11) ;