M。培养基，置于22°C黑暗培养箱培养3-5天至种子萌 发。
[0018] (7)在超净工作台中，剪取新生的子叶，用手术刀将其分开并切成2-3个小块，外 植体制备完成。
[0019] 、农杆菌的活化与准备 (1)将保存的菌种在抗性平皿（LB+50mg/LGentamycin+50mg/LKm)上划线活化， 28°C培养3天，挑取活化的含有目标质粒的农杆菌单菌落到5mlLB+ 25mg/LGent+ 50 mg/LKm的液体培养基，28°C，220rpm摇床上活化24h，。
[0020] (2)按照1:50的比例将活化的菌液接种到50mlLB+庆大霉素25mg/L+卡 那霉素50mg/L的培养基中，28°C，220rpm转速下培养8-16h，至菌液0D6QQ=0.8。
[0021] (3)取20ml新鲜培养的菌液，室温5000rpm离心15min。弃上清，加入20ml DM培养基，用5ml移液器轻轻将农杆菌菌体悬浮于DM培养基里。
[0022] (4)重复步骤（3)-次，取2ml悬浮菌液稀释到20mlDM培养基中，农杆菌准备 完成，在2h内使用效果不受影响。
[0023] 、菊苣遗传转化 (1)转化：将步骤2准备的外植体以及步骤3准备的农杆菌一起放到无菌培养皿中，浸 染15-20min(时间不能长，不然外植体易死亡），隔4-5min轻轻摇晃培养皿一次，使农 杆菌与外植体充分接触。浸染时以每20ml菌液侵染200-300个外植体效果最好。
[0024] (2)共培养：尽量吸掉多余的菌液，将侵染好的外植体转到乂培养基中，每皿 60-70个外植体，置于人工气候室，16h光照，8h黑暗，光照强度为230 - 300yEm2s\ 24°C的条件下共培养2-3天。
[0025] (3)诱导愈伤：用无菌水清洗共培养的外植体2-3次，然后将共培养的外植体均匀 放置于％培养基上，每皿放置30-40个，培养条件同共培养。
[0026] 采用本发明的方法能形成正常愈伤，与现有技术的效率相当，而直接用农杆菌侵 染不经预培养的真叶外植体，愈伤形成率只有〇%~1 %，基本不能形成绿色愈伤组织(表 2)〇
[0027] (4)诱导再生芽：将绿色愈伤转到％培养基中，每星期继代一次，直至绿芽长至 2-5cm，培养条件同共培养。
[0028] 采用本发明的方法再生苗分化率与现有技术的方法相当，形成玻璃化的比例为 2-5%，降低到现有技术的玻璃化率的20%左右(表3)。
[0029] (5)诱导生根：将再生植株从愈伤组织上切下，将其插入到M4培养基中生根培养 15-20天，直到根系发育完成，培养条件同共培养。
[0030] (6)移栽：将培养瓶盖打开，加入5-10ml无菌水，在人工气候室开盖炼苗5-7天， 将无菌苗取出，洗净根部的琼脂，移栽到泥炭土 ：蛭石=1:1的基质中，培养条件同共培养。
[0031] 、转基因菊苣鉴定 (1 )DNA提取：用于PCR的转化植株DNA的提取采用天根DNA提取试剂盒（DP305-2)，具 体操作过程参照试剂盒说明书。
[0032] (2)PCR扩增：PCR反应采用上海生工2XTaqPCR反应试剂盒，利用表 达载体上Km抗性基因上游引物NPTF[5' -GTGCCCTGAATGAACTGC-3' ]与下游引物 NPTR[5' -CAATATCACGGGTAGCCA-3' ]组合进行PCR检测。配制PCR反应混合物：
反应的时间和温度作如下： 94°C3min, 94〇C30s, 58°C45s 72〇C30s,30cycles72°C5min 检测结果显示，大部分转化植株均能够扩增出预期大小的电泳条带，而阴性对照则没 有，表明转化材料中已经含有外源基因DNA片段，结果如（图4)示，阳性植株的比例达到 98.5% (n=140)〇
[0033] 本发明所述并不限于【具体实施方式】中所述的实施例，本领域技术人员根据本发明 的技术方案得出其他的实施方式，同样属于本发明的技术创新范围。显然本领域的技术人 员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的 这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术范围内，则本发明也意图包含这些改动 和变型在内。
【主权项】
1. 一种免预培养高效菊苣遗传转化方法，其特征在于：将消毒好的菊苣种子播种于种 子培养基中，完全遮光培养3-5天；取分生能力旺盛的子叶组织来制备外植体；将制备的外 植体直接用农杆菌侵，进行农杆菌转化，获得浸染好的外植体；将浸染好的外植体采用共培 养培养基在光照条件下进行共培养，获得共培养外植体；将共培养外植体清洗后，采用愈伤 诱导培养基在光照条件下进行诱导愈伤，获得愈伤外植体；将愈伤外植体采用分化培养基 在光照条件下进行诱导再生芽，使外植体的愈伤组织上产生再生植株；将再生植株从愈伤 组织上切下后，采用生根培养基在光照下进行生根，直到根系发育完成；炼苗5-7天后，将 无菌苗移栽至基质中。2. 根据权利要求1所述的免预培养高效菊苣遗传转化方法，其特征在于：所述的种子 萌发培养基是以1/2 MS为基础，包括10 g/L蔗糖及8 g/L琼脂；共培养培养基是以MS培 养基为基础，包括10 g/L蔗糖、8 g/L琼脂、0.01 mg/L TDZ及lmg/L IAA;愈伤诱导培养基 是以MS培养基为基础，包括15 g/L蔗糖、10 g/L琼脂、2 mg/L 6-BA、1 mg/L IAA、300 mg/ L头孢霉素及25 mg/L卡那霉素；分化培养基是以MS培养基为基础，包括15 g/L蔗糖、10 g/L琼脂、I mg/L 6-BA、l mg/L IAA+300 mg/L头孢霉素及25 mg/L卡那霉素；生根培养基 是以MS培养基为基础，包括10 g/L蔗糖、7 g/L琼脂、I mg/L NAA及300 mg/L头孢霉素。
【专利摘要】本发明提供了一种免预培养高效菊苣遗传转化方法。本发明采用子叶组织作为外植体，与传统外植体真叶相比，本发明采用的子叶外植体可以由消毒的种子萌发而来，而子叶由于有种皮保护，因此，可以采用酒精和84消毒液灭菌方法，同时也保护了实验操作者和环境免受升汞的危害。本发明简化了实验步骤、缩短了实验时间、极大地减少了实验成本。本发明外植体准备只要3-5天,而且不需要经过预培养；由于子叶细胞贮存了丰富的营养物质，因此利用黑暗条件抑制子叶细胞分裂，在恢复光照条件后其利用自身营养物质迅速分裂的特点，不需要对外植体预培养可直接用于遗传转化，极大的减少了人力、物力与时间成本。
【IPC分类】C12N15/84, A01H5/00
【公开号】CN105112442
【申请号】CN201510265745
【发明人】李小冬, 于二汝, 舒健虹, 王小利, 莫本田, 蔡一鸣, 吴佳海, 韩永芬
【申请人】贵州省草业研究所
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年5月24日