一种脂环化合物修饰的高分子材料及其制备方法与应用_3

文档序号:8936863阅读:来源:国知局
树形高分子,具有中心核,末端基团为伯胺基 团;
[0096] S=HC12,为环十二烷;
[0097] m表示环十二烷共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高分子表面的数量;
[0098] 其中,G5的结构如式(2A)所示:
[0099]
[0100] 式(2A)中,M是第5代聚酰胺-胺树形高分子G5的中心核:乙二胺。
[0101] 在本发明中,M还可以是氨、乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、葵二胺或1,12-十二 烷二胺。
[0102] -个具体的实施方式中,式(1D)所示基因转染载体G5-NC0-HC12-m的制备方法为: 取30mg的第5代聚酰胺-胺树形高分子溶于2毫升二甲亚砜溶剂中,再加入一定量的环 十二烷基异氰酸酯,将该反应在37摄氏度下搅拌反应48小时,分离提纯,然后冷冻干燥,即 可得到外观为白色粉末的基因转染载体即脂环化合物修饰的高分子材料G5-NC0-HC12-m。
[0103] 对按上述步骤制备得到的基因转染载体G5-NC0-HC12-m进行核磁共振分析,如图9 所示为基因转染载体的一维核磁共振图谱,环十二烷共价连接到第5代聚酰胺-胺树形高 分子表面在数量分别为33和48个。
[0104] (5)如图5所示为基于高分子骨架和脂环化合物功能集团的基因转染载体即脂 环化合物修饰的高分子材料PEI-NC0-HC12-m的合成路线及该基因转染载体的结构示意图,PEI-NC0-HC12-m的结构式如以下式(1E)所示:
[0105]
[0106]其中,R=PEI,即支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物,分子量为25000 ;
[0107] S=HC12,为环十二烷;
[0108] m表示环十二烷共价连接到支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物表面的数量;
[0109] 其中,PEI的结构如式(3A)所示:
[0110]
[0111] 式(3A)中,n为支化单元重复数量,n为52。
[0112] 在本发明中,PEI还可以是线状聚乙烯亚胺阳离子聚合物,分子量为1800~25000 不等。
[0113] -个具体的实施方式中,式(1D)所示基因转染载体PEI-NC0-HC12-m的制备方法 为:取30mg的支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物溶于3毫升甲醇溶剂中,再加入一定量的环 十二烷基异氰酸酯,将该反应在37摄氏度下搅拌反应48小时,分离提纯,然后冷冻干燥,即 可得到外观为白色粉末的基因转染材料PEI-NC0-HC12-m。
[0114] 对按上述步骤制备得到的基因转染载体PEI-NC0-HC12-m进行核磁共振分析,如图 10所示为该基因转染载体的一维核磁共振图谱,环十二烷共价连接到支化聚乙烯亚胺阳离 子聚合物表面的数量分别为24、34、42,91和116个。
[0115] 实施例2 :基因转染载体G5-NC0-HC5-29在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的效 率实验
[0116] 将实施例1中制得的基因转染载体G5-NC0-HC5-29和荧光素酶luciferasesiRNA 在室温下形成复合物,然后在Hela-luci细胞中进行转染,通过检测荧光素酶的表达量来 评估G5-NC0-HC5-29的基因转染效率。具体实验方法为:将Hela-luci细胞在24孔板中孵 育24小时,将50nM的luciferasesiRNA与一定量的G5-NC0-HC5-29混合后加入到培养基 中混匀;与细胞一起孵育6小时后加入500微升含10%血清的培养基,18小时后处理细胞。 焚光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。Lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0117] 实验结果:
[0118] 如图11所示为基因转染载体G5-NC0-HC5_29在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因 的效率,表明含脂环化合物环戊烷的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料作为基因输送载体 可以有效地将焚光素酶luciferasesiRNA输送到细胞抑制焚光素酶luciferase的表达。
[0119] 实施例3 :基因转染载体G5-NC0-HC7-64在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的效 率实验
[0120] 将实施例1中制得的基因转染载体G5-NC0-HC7_64和荧光素酶luciferasesiRNA 在室温下形成复合物,然后在Hela-luci细胞中进行转染,通过检测荧光素酶的表达量来 评估G5-NC0-HC7-64的基因转染效率。具体实验方法为:将Hela-luci细胞在24孔板中孵 育24小时,将50nM的luciferasesiRNA与一定量的G5-NC0-HC7-64混合后加入到培养基 中混匀;与细胞一起孵育6小时后加入500微升含10%血清的培养基,18小时后处理细胞。 焚光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。Lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0121] 实验结果:
[0122] 如图12所示为基因转染载体G5-NC0-HC7_64在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因 的效率,表明含脂环化合物环庚烷的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料作为基因输送载体 可以有效地将焚光素酶luciferasesiRNA输送到细胞抑制焚光素酶luciferase的表达, 使荧光素酶活性降低到64. 3%。
[0123] 实施例4 :基因转染材料G5-NC0-AD-63在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的效 率实验
[0124] 将实施例1中制得的基因转染载体G5-NC0-AD-63和荧光素酶luciferasesiRNA 在室温下形成复合物,然后在Hela-luci细胞中进行转染,通过检测荧光素酶的表达量来 评估G5-NC0-AD-63的基因转染效率。具体实验方法为:将Hela-luci细胞在24孔板中孵 育24小时,将50nM的luciferasesiRNA与一定量的G5-NC0-AD-63混合后加入到培养基 中混匀;与细胞一起孵育6小时后加入500微升含10%血清的培养基,18小时后处理细胞。 焚光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。Lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0125] 实验结果:
[0126] 如图13所示为基因转染载体G5-NC0-AD-63在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因 的效率,表明含脂环化合物金刚烷的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料作为基因输送载体 可以有效地将焚光素酶luciferasesiRNA输送到细胞抑制焚光素酶luciferase的表达, 使得荧光素酶活性降低到16. 5%,其效果优于Lipofectamine2000的27. 2%。
[0127] 实施例5 :基因转染载体G5-NC0-HC12_33在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的 效率实验
[0128] 将实施例1中制得的基因转染材料G5-NC0-HC12_33和荧光素酶luciferasesiRNA 在室温下形成复合物,然后在Hela-luci细胞中进行转染,通过检测荧光素酶的表达量来 评估G5-NC0-HC12-33的基因转染效率。具体实验方法为:将Hela-luci细胞在24孔板中孵 育24小时,将50nM的luciferasesiRNA与一定量的G5-NC0-HC12-33混合后加入到培养基 中混匀;与细胞一起孵育6小时后加入500微升含10%血清的培养基,18小时后处理细胞。 焚光素酶表达量的检测方法参照出厂商(Promega公司)提供的使用说明。Lipofectamine 2000作为阳性对照。
[0129] 实验结果:
[0130] 如图14所示为基因转染载体G5-NC0-HC12_33在Hela-luci细胞中敲除荧光素基 因的效率,表明含脂环化合物环十二烷的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料作为基因输送 载体可以有效地将焚光素酶luciferasesiRNA输送到细胞抑制焚光素酶luciferase的表 达,使得荧光素酶活性降低到26. 5%,其效果优于Lipofectamine2000的27. 2%。
[0131] 实施例6 :基因转染材料G5-NC0-HC12-48在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的 效率实验。
[0132] 将实施例1中制得的基因转染材料G5-NC0-HC12-48、G5和lipofectamine分别 和焚光素酶luciferasesiRNA与非特异性的siRNA(scrambledsiRNA)在室温下形成复 合物,然后在Hela-luci细胞中进行转染,通过检测荧光素酶的表达量来评估材料的基 因转染效率。具体实验方法为:将Hela-luci细胞在24孔板中孵育24小时,将50nM的 luciferasesiRNA
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