，scrambledsiRNA与不同质量的G5-NC〇-HC12-48、G5 和lipofectamine 混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入500微升含10%血清的培养 基，18小时后处理细胞。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商（Promega公司）提供的使 用说明。第五代聚酰胺-胺树形高分子G5作为阴性对照，Lipofectamine2000作为阳性 对照。
[0133] 实验结果：
[0134] 如图15所示为基因转染载体G5-NC0-HC12_48在Hela-luci细胞中敲除荧光素基 因的效率，表明含脂环化合物环十二烷的第五代聚酰胺-胺树形高分子材料作为基因输送 载体可以有效地将焚光素酶luciferasesiRNA输送到细胞抑制焚光素酶luciferase的表 达，使得荧光素酶活性降低到13. 7%，其效果优于Lipofectamine2000的16. 1 %和第五代 聚酰胺-胺树形高分子G5的85. 3%。
[0135] 实施例 7 :基因转染载体PEI-NC0-HC12-91，PEI-NC0-HC12-116 和PEI-NC0-C12-101 在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的效率实验
[0136] 将实施例1中制得的基因转染材料PEI-NC0-HC12-91，PEI-NC0-HC12-116和对照材 料PEI-NC0-C12-101 (在PEI上面连接101条链状十二烷）和荧光素酶luciferasesiRNA 在室温下形成复合物，然后在Hela-luci细胞中进行转染，通过检测荧光素酶的表达量来 评估这三种材料的基因转染效率。具体实验方法为：将Hela-luci细胞在24孔板中孵育 24 小时，将 50nM的luciferasesiRNA与一定量的PEI-NC0-HC12-91，PEI-NC0-HC12-116， PEI-NC0-C12-101混合后加入到培养基中混匀；与细胞一起孵育6小时后加入500微升含 10%血清的培养基，18小时后处理细胞。荧光素酶表达量的检测方法参照出厂商（Promega 公司）提供的使用说明。Lipofectamine2000作为阳性对照。
[0137] 实验结果：
[0138] 如图 16 所示为基因转染载体PEI-NC0-HC12-91，PEI-NC0-HC12-116， PEI-NC0-C12-101在Hela-luci细胞中敲除荧光素基因的效率，表明含脂环化合物环 十二烷的支化聚乙烯亚胺阳离子高分子材料作为基因输送载体可以有效地将荧光素酶 luciferasesiRNA输送到细胞抑制荧光素酶luciferase的表达，PEI-NC0-HC12_91使得荧 光素酶活性降低到23. 7%，PEI-NC0-HC12-116使得荧光素酶活性降低到19. 3%，其效果优 于Lipofectamine2000 的 26. 4%，和对照材料的PEI-NC0-C12-101 的 36. 4%。
[0139] 实施例8 :基因转染材料G5-NC0-HC12_33对Hela-luci细胞的细胞毒性实验
[0140] 本发明的实施例1中制得的基因转染材料G5-NC0-HC12-33的细胞毒性，具体实验 方法为：在96孔板中孵育Hela-luci细胞，细胞密度为104细胞/孔，培养12小时后将培 养基移出，加入100微升分别含有100微克G5-NC0-HC12-33,G5-NC0-C12-30(在第五代聚酰 胺-胺树形高分子G5上连接30条链状十二烷）的新鲜培养基（含10 %血清），培养24小 时。通过MTT法检测基因转染材料G5-NC0-HC12-33,G5-NC0-C12-30对细胞的毒性。
[0141] 实验结果：如图17所示为基因转染载体G5-NC0-HC12-33,G5-NC0-C12-30对 Hela-luci细胞的毒性。图17表明，基因转染载体G5-NC0-HC12-33在远高于转染剂量即最 佳转染剂量1微克的条件下，仍然具有较低的细胞毒性，细胞存活率为90%，显著高于链烷 烃修饰的高分子材料G5-NC0-C12-30的44. 4%，表现出更低的细胞毒性。
[0142] 以上实施例只是为了说明本发明技术构思及特点，让本领域普通技术人员能够了 解本
【发明内容】
并据以实施，并不能以此限制本发明保护范围。凡是根据本
【发明内容】
的实质 所作的等效变化和修饰，都应涵盖在本发明保护范围内。
【主权项】
1. 一种脂环化合物修饰的高分子材料，其特征在于，其包括脂环化合物功能基团和阳 离子高分子骨架，所述脂环化合物功能基团与所述阳离子高分子骨架表面共价连接；所述 高分子材料的结构如式（1)所示： R-(Y-S)x 式⑴， 式⑴中， γ 为 nhconh，nhcsnh，nhchohch2, nhch2choh，NH 或 NHCO 基团； S为所述脂环化合物功能基团； R为所述阳离子高分子骨架； X为1-1024的整数。2. 如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述S为如式（2)所示的环戊烷、如 式⑶所示的环己烷、如式⑷所示的环庚烷、如式（5)所示的环辛烷、如式（6)所示的环 壬烷、如式（7)所示的金刚烷、如式（8)所示的环十一烷或如式（9)所示的环十二烷：3. 如权利要求2所述的高分子材料，其特征在于，所述S为如式（2)所示的环戊烷、如 式（4)所示的环庚烷、如式（7)所示的金刚烷或如式（9)所示的环十二烷。4. 如权利要求1所述的高分子材料，其特征在于，所述R为如式（10)所示的聚酰胺-胺 树形高分子、如式（11)所示的聚丙烯亚胺树形高分子、如式（12)所示的聚赖氨酸树形高分 子、如式（13)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物或如式（14)所示的线性聚乙烯亚胺阳 离子聚合物；CN 105153433 A 平乂不U 安氷 2/3 页其中，在式（10)、式（11)及式（12)中，M为高分子材料的核心，包括氨、乙二胺、丁二 胺、己二胺、辛二胺、葵二胺和1，12-十二烧二胺；η为1-10的整数；m为2-4的整数； 在式（13)中，η为支化单元的重复数，所述支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物的分子量为 600-100000 ； 在式（14)中，η为乙烯亚胺的重复数，所述线性聚乙烯亚胺阳离子聚合物的分子量为 600-100000。5. 如权利要求4所述的高分子材料，其特征在于，所述R为如式（10)所示的聚酰胺-胺 树形高分子，其中，或如式（13)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物。6. 如权利要求2所述的高分子材料，其特征在于，所述R为如式（10)所示的聚酰胺-胺 树形高分子、如式（11)所示的聚丙烯亚胺树形高分子、如式（12)所示的聚赖氨酸树形高分 子、如式（13)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物或如式（14)所示的线性聚乙烯亚胺阳 离子聚合物； 所述 Y 为 nhconh，nhcsnh，nhchohch2, nhch2choh，NH 或 NHCO 基团。7. 如权利要求6所述的高分子材料，其特征在于，所述R为如式（10)所示的聚酰胺-胺 树形高分子，或如式（13)所示的支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物； 所述Y为NHCONH基团； 所述S为如式（2)所示的环戊烷、如式（4)所示的环庚烷、如式（7)所示的金刚烷或如 式（9)所示的环十二烷。8. -种脂环化合物修饰的高分子材料的制备方法，其特征在于，将脂环化合物和高分 子溶解于水或有机溶剂中，充分搅拌反应，得到如权利要求1所述高分子材料；所述有机溶 剂为甲醇、乙醇、二甲亚砜、N，N-二甲基甲酰胺或四氢呋喃。9. 如权利要求1所述的高分子材料作为生物大分子转染载体的应用，其特征在于，所 述生物大分子包括核酸、蛋白质和核酸与蛋白质的复合物；所述核酸为DNA、siRNA、shRNA、 microRNA或修饰的核酸。10. 如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物大分子为核酸。
【专利摘要】本发明提供一种脂环化合物修饰的高分子材料，包括脂环化合物功能基团和阳离子高分子骨架，所述脂环化合物功能基团与所述阳离子高分子骨架表面共价连接，所述阳离子高分子骨架包括聚酰胺-胺树形高分子、聚丙烯亚胺树形高分子、聚赖氨酸树形高分子、支化聚乙烯亚胺阳离子聚合物和线性聚乙烯亚胺阳离子聚合物。本发明还提供一种所述高分子材料的制备方法以及作为生物大分子转染载体的应用。本发明的高分子材料合成成本低廉，细胞毒性小，生物相容性高，能有效且安全地将基因分子输送到细胞中，可作为兼具高效、低毒、低成本等优点的基因转染载体，具有良好的应用前景。
【IPC分类】C08G69/48, C12N15/87, C08G83/00, C08G73/04
【公开号】CN105153433
【申请号】CN201510565983
【发明人】程义云, 沈湾湾, 刘红梅
【申请人】华东师范大学
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月8日