0化pm离屯、lOmin。弃上清，沉淀用70% 的乙醇洗涂两次，真空干燥，加入适量dd&0溶解，置于-20°C备用。
[0056] 根据己发表的纤维素酶基因保守序列设计合成了兼并引物，WProsthecium opalus总DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应参数为：95°C5min;94°C30sec, 50~ 45°C30sec，72°C30sec，12个循环（其中每个循环后复性溫度下降I°C); 94°C30min, 45°C30sec, 72°C30sec, 30 个循环；72°ClOmin。得到一约 340bp片段，将该片 段回收后送眷博生物技术有限公司测序。
[0057] 根据测序得到的核甘酸序列设计TAlX-PCR引物Uspl，usp2 ;dspl，dsp2 (见表1)。 通过TAIL-PCR得到已知基因序列的侧翼序列，扩增得到产物回收后送S博生物技术有限 公司测序。测序正确的片断经拼接后获得全长基因。
[0058] 表1本实验所需的引物
[0059]
[0060]实施例2纤维素酶cDNA的获得
[006。提取？1'031:11日(3；[1111109日1113总1?酷，利用011旨0((11')2。和反转录酶得到。0臟的一条 链，然后设计扩增开放阅读框的的引物F和R(见表1)，扩增该单链cDNA，获得纤维素酶的CDNA序列，扩增得到产物回收后送眷博生物技术有限公司测序。
[0062] 通过对纤维素酶的基因组序列和CDNA序列比对后发现该基因有含有1个内含子， CDNA长993bp，编码330个氨基酸和一个终止密码子，N端19个氨基酸为其信号肤序列，经 比对证明从Prostheciumopalus中分离克隆得到的编码纤维素酶的基因为新基因。
[0063] 实施例3纤维素酶工程菌株的构建
[0064] (1)表达载体的构建及在酵母的表达
[0065]W测序正确的纤维素酶Cel5的CDNA为模板，设计合成了带有EcoRI和NotI限 制性酶切位点的引物F和R(见表1)，对Cel5的成熟蛋白的编码区进行扩增。并利用EcoR I和NotI酶切PCR产物，连接进入表达载体PPIC9 (Invitrogen，SanDiego)，纤维素酶 Cel5成熟蛋白的序列插入到上述表达载体的信号肤序列的下游，与信号肤形成正确的阅读 框架，构建成酵母表达载体pPIC9-cel5,转化大肠杆菌感受态细胞化ansi。阳性转化子进 行DNA测序，测序表明序列正确的转化子用于大量制备重组质粒。用限制性内切酶BglII 进行线性化表达质粒载体DNA，电击转化酵母GS115感受态细胞，30°C培养2-3天，挑取在 MD平板上生长的转化子进行进一步的表达实验，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0066]W同样的方式构建含Cel5信号肤序列的CDNA的表达载体，并转化。
[0067] 似高纤维素酶活性转化子的筛选
[0068] 用灭过菌的牙签从长有转化子的MD板上挑取单菌落，按照编号先点到MD平板上， 将MD平板置于3(TC培养箱中培养1~2天，至菌落长出。按编号从MD平板上挑取转化子 接种于装有3mLBMGY培养基的离屯、管中，30°C、220巧m摇床培养4她；将摇床培养4她的 菌液3,OOOXg离屯、15min，去上清，离屯、管中再加入1血含有0. 5%甲醇的BMMY培养基，在 30 °C、220巧m诱导培养；诱导培养4化后，3,OOOXg离屯、5min，取上清用于酶活性检测，从 中筛选出高纤维素酶活性的转化子，具体操作请参考毕赤酵母表达操作手册。
[0069] 实施例4重组纤维素酶的制备
[0070] (1)纤维素酶基因Cel5在毕赤酵母中摇瓶水平的大量表达
[0071] 筛选出酶活较高的转化子，接种于300血BMGY液体培养基的ILS角瓶中，30°C， 22化pm摇床振荡培养4她；5, 00化pm离屯、5min，轻柔弃上清，再向菌体加入IOOmL含有 0. 5%甲醇的BMMY液体培养基，30°C，220巧m诱导培养72h。诱导培养期间，间隔24h补加一 次甲醇溶液W补偿甲醇的损失，使甲醇浓度保持在0. 5 %左右；（3) 12,OOOXg离屯、lOmin， 收集上清发酵液，检测酶活性并进行SDS-PAGE蛋白电泳分析。
[0072] (2)重组纤维素酶的纯化
[0073] 收集摇瓶表达的重组纤维素酶上清液，通过IOkDa膜包进行浓缩，同时用低盐缓 冲液置换其中的培养基，然后用IOkDa超滤管进一步的浓缩。浓缩能稀释到一定倍数的 重组Cel5,通过离子交换层析进行纯化。具体地，取Cel5浓缩液2. 0血经预先用20mM Tris-肥1 (抑7. 5)平衡过的HiTrapQSe地arose化阴离子柱，然后用0-lmol/L的化Cl 进行线性梯度洗脱，对分步收集的洗脱液检测酶活性和进行蛋白浓度的测定。
[0074] 实施例5重组纤维素酶部分性质分析
[007引采用DNS法对本发明的纤维素酶进行活性分析。具体方法如下：在抑5. 0,60°C条 件下，1血的反应体系包括100JiL适当的稀释酶液，900JiL底物，反应lOrnin，加入1. 5血 DNS终止反应，沸水煮5min。冷却后540nm测定OD值。纤维素酶活性单位定义：在一定条 件下，每分钟分解簇甲基纤维素生成1ymol还原糖所需的酶量为1个活性单位扣)。
[0076] (1)纤维素酶Cel5的最适抑及抑稳定性
[0077] 经纯化的实施例4表达的纤维素酶Cel5在不同的抑下进行酶促反应W测定其最 适抑。所用缓冲液为抑1.0~3.0甘氨酸-盐酸缓冲液，PH3.0~8.0的巧樣酸一憐酸氨 二钢系列缓冲液及pH8. 0~10. 0化is-HCl系列缓冲液。纯化的纤维素酶Cel5在不同pH的 缓冲体系.60°C下测定的抑适性结果（图1)表明：CelS的最适抑为5. 0,在抑4. 5-p册.0 范围内，该酶能够维持其70%W上的酶活力。
[0078] 将酶液在不同抑值的缓冲液中于37°C下处理60min，再测定酶活性W研究酶的抑 稳定性。结果表明（图2)，分析结果表明pH4.0-pH9.0之间能够维持30%W上的酶活力， 说明该酶具有优良的抑稳定性。
[0079] (2)纤维素酶Cel5反应最适溫度及热稳定性
[0080] 纯化的纤维素酶在抑5.0条件下，测定不同溫度（40-80°C)下的酶活性，分析实 验结果表明显示，该酶的最适反应溫度为60°C，在70°C时依然具有50%W上的酶活力（图 3)。耐溫性测定为纤维素酶在不同溫度下处理不同时间，再在60°C下进行酶活性测定。热 稳定性实验表明：该纤维素酶在50°C下处理60min，剩余酶活在85%W上，即使该酶在60°C 下处理20min，依然能够保持37%的酶活力，运表明该酶具有较好的稳定性（图4)。
[0081] (3)比较广泛的底物特异性
[0082] 在最适PH与最适溫度下，将该纤维素酶与不同种类的底物反应相同时间，分析实 验结果表明，该酶能够降解大麦葡聚糖（141抓/mg),簇甲基纤维素钢巧79U/mg)，地衣多糖 (1301U/mg)，角豆胶巧8mg/ml)，魔芋粉（268U/mg)。结果表明，对于纤维素和半纤维素类的 底物，该酶均可W降解，运使得该酶更适合应用于工业生产。
[0083] (4)发酵生产特性
[0084] 该酶在摇瓶发酵水平上可W达到1542U/ml，该表达量相比于其他同类纤维素酶表 达系统的发酵水平。因此，该基因具有高比活性，表达量较高，可W降低生产成本，更易于后 期高效发酵生产。
【主权项】
1. 一种纤维素酶Cel5,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 2所 不。2. -种纤维素酶基因，其特征在于，编码权利要求1所述的一种纤维素酶Cel5。3. 根据权利要求2所述的纤维素酶基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 3、 SEQ ID NO. 4 或 SEQ ID NO. 5 所示。4. 包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体。5. 包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组表达载体pPIC9-Cel5。6. 包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组菌株。7. 包含权利要求2所述纤维素酶基因的重组菌株GS115/Cel5。8. -种制备纤维素酶Cel5的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 以权利要求4所述的重组表达载体转化宿主细胞； (2) 培养宿主细胞； (3) 分离纯化获得纤维素酶Cel5。9. 权利要求1所述纤维素酶Cel5的应用。
【专利摘要】本发明涉及基因工程领域。具体地，本发明涉及一种来源于真菌的酸性纤维素酶及其基因和应用，其氨基酸序列如SEQ？ID？NO.1或SEQ？ID？NO.2所示。本发明提供了一个新的纤维素酶基因，其编码的纤维素酶具有良好的性质，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明的技术方案就可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的纤维素酶。
【IPC分类】C12N9/42, C12N15/56, C12N15/81, C12R1/84, C12N1/19
【公开号】CN105154417
【申请号】CN201510706495
【发明人】姚斌, 罗会颖, 郑菲, 苏小运, 石鹏君, 柏映国, 黄火清, 王亚茹, 孟昆, 师霞, 马锐
【申请人】中国农业科学院饲料研究所
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月27日