体的用途，使黄绿蜜环菌子实体成为抗肝癌药物的有效样品原料，显著提高黄绿蜜环菌子实体的附加值。
[0034]5、本发明工艺简单、回收率高、重复性较好、质量稳定可控，所得到的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌留醇类活性样品(第FrS-1号样品和第Fr8-4号样品)经NMR氢谱、碳谱分析，分别判定为 3 β -hydroxy- (22E, 24R) -ergosta-5, 8, 22-trien-7_one 和(3 α，5 α )，(8β , 11 β ) -diepid1xy-ergost-22E-en-12-one (参见图 5)。
【附图说明】
[0035]下面结合附图对本发明的【具体实施方式】作进一步详细的说明。
[0036]图1为本发明黄绿蜜环菌子实体标准化组分的制备色谱图。
[0037]图2为本发明黄绿蜜环菌子实体标准化组分的抗肝癌活性检测图。
[0038]图3为本发明黄绿蜜环菌子实体第八号标准化组分的制备色谱图。
[0039]图4为本发明黄绿蜜环菌子实体第FrS-1?Fr8_4号样品的抗肝癌活性检测图。
[0040]图5本发明黄绿蜜环菌子实体第Fr8-1和第Fr8_4号样品的化合物结构式。
【具体实施方式】
[0041]实施例1 一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，包括以下步骤:
[0042]⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物加入其体积的I倍50%正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μπι的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以10 μπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、FrlO、Frl2、、Frl3、Frl4 共 14 个标准化组分样品；
[0043]其中:
[0044]减压浓缩的条件是指真空度为0.06MPa，温度为70°C。
[0045]制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X 50mm ;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0?15min，100% A?100% A ;15?35min，60% A?60%A ；35?50min,0% A?0% A ;检测波长为260nm ;上样量为1.0g0
[0046]⑵将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
[0047]①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5% 0)2培养箱工作正常；
[0048]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；
[0049]③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
[0050]④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X 14个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ;
[0051]⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5 μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；
[0052]⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0053]⑶将第8号标准化组分加入其体积的2倍20%正己烧-乙醇混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含第8号标准化组分的样品溶液；所述含第8号标准化组分的样品溶液在以10 μπι XAmide为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Fr8_l、Fr8-2、Fr8-3、Fr8_4 共 4 个样品；
[0054]其中:
[0055]减压浓缩的条件是指真空度为0.06MPa，温度为70°C ;
[0056]制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为250 X 20mm ;采用A为正己烷、B为乙醇的二元流动相体系进行分离:0?40min，97% A?92% A ;检测波长为260nm ;上样量为0.15或 0.3g0
[0057]⑷将所述4个样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选:
[0058]①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5% 0)2培养箱工作正常；
[0059]②8孔细胞板内按150 μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基；
[0060]③将所述4个样品中的每个样品用DMSO配制成浓度为5mg/mL的样品溶液；
[0061]④将对数生长期的人肝癌细胞H印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85 X 14个/mL，得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ;
[0062]⑤将所述4个样品分两批按每孔加5 μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞H印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应；
[0063]⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第FrS-1号样品和第Fr8-4号样品具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0064]所得到的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌留醇类活性样品(第FrS-1号样品和第Fr8_4号样品)经NMR氢谱、碳谱分析，分别判定为3 β -hydroxy-(22Ε, 24R) -ergosta-5, 8, 22-trien-7-one 和(3 α, 5α), (8 β , 11 β ) -diepid1xy-ergost-22E-en-12-one (参见图 5)。
[0065]实施例2 —种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，包括以下步骤:
[0066]⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物加入其体积的6倍10%正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μπι的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Frl、Fr2、……、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品；
[0067]其中:
[0068]减压浓缩的条件是指真空度为0.09MPa，温度为50°C。
[0069]制备色谱分离的条件同实施例1步骤⑴。
[0070]⑵将5个组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0071 ] ⑶将第8号标准化组分加入其体积的5倍5 %正己烷-乙醇混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含第8号标准化组分的样品溶液；所述含第8号标准化组分的样品溶液在以10 μπι XAmide为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Fr8_l、Fr8-2、Fr8-3、Fr8_4 共 4 个样品；
[0072]其中:
[0073]减压浓缩的条件是指真空度为0.09MPa，温度为50°C ;
[0074]制备色谱分离的条件同实施例1步骤⑵。<