br>[0075]⑷将4个样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第Fr8-1和第Fr8-4号样品具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0076]实施例3 —种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，包括以下步骤:
[0077]⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物加入其体积的3倍30%正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μπι的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以ΙΟμπι硅胶为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Frl、Fr2、……、Fr 13、Fr 14共14个标准化组分样品；
[0078]其中:
[0079]减压浓缩的条件是指真空度为0.08MPa，温度为60°C。
[0080]制备色谱分离的条件同实施例1步骤⑴。
[0081]⑵将5个组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0082]⑶将第8号标准化组分加入其体积的3倍10%正己烧-乙醇混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含第8号标准化组分的样品溶液；所述含第8号标准化组分的样品溶液在以10 μπι XAmide为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Fr8_l、Fr8-2、Fr8-3、Fr8_4 共 4 个样品；
[0083]其中:
[0084]减压浓缩的条件是指真空度为0.08MPa，温度为60°C ;
[0085]制备色谱分离的条件同实施例1步骤⑵。
[0086]⑷将4个样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按实施例1所述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选，确定第Fr8-1和第Fr8-4号样品具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。
[0087]上述实施例1?3中黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法所得的活性化合物作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂应用于肝癌治疗中。
【主权项】
1.一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ⑴黄绿蜜环菌丙酮提取物加入其体积的1?6倍10%?50%正己烷-乙酸乙酯混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含丙酮提取物的样品溶液；所述含丙酮提取物的样品溶液在以10 μ m硅胶为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Frl、Fr2、Fr3、Fr4、Fr5、Fr6、Fr7、Fr8、Fr9、FrlO、Frl2、、Frl3、Frl4 共 14 个标准化组分样品； ⑵将所述14个标准化组分样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选: ①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%0)2培养箱工作正常； ②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基； ③将所述14个标准化组分样品中的每个组分样品用DMS0配制成浓度为5mg/mL的样品溶液； ④将对数生长期的人肝癌细胞Η印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85X 104个/ml,得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ; ⑤将所述14个标准化组分样品分两批按每孔加5μ L所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞Η印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应； ⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第7、第8、第9、第10、第11、第13以及第14号标准化组分具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。 ⑶将第8号标准化组分加入其体积的2?5倍5%?20%正己烷-乙醇混合液进行溶解，溶解后过0.45 μ m的有机滤膜，得到含第8号标准化组分的样品溶液；所述含第8号标准化组分的样品溶液在以10 μπι XAmide为分离基质的制备色谱上分离并减压干燥，即得Fr8-1、Fr8-2、Fr8_3、Fr8-4 共 4 个样品； ⑷将所述4个样品采用iCelligence实时无标记细胞分析仪按下述步骤进行体外抗肝癌细胞模型筛选: ①确认iCelligence测试系统正确连接，37°C、5%0)2培养箱工作正常； ②8孔细胞板内按150μ L/孔加入培养基，室温放置15分钟后置于iCelligence测试台上测基线；所述培养基是指含10%胎牛血清的低糖DMEM培养基； ③将所述4个样品中的每个样品用DMS0配制成浓度为5mg/mL的样品溶液； ④将对数生长期的人肝癌细胞Η印G2，用胰酶按常规方法消化后，以950rpm的速率离心5min，将细胞重悬于所述培养基中，并将细胞浓度调至2.85X 104个/ml,得到对数生长期的人肝癌细胞HepG2悬液，并按345 μ L/孔、每孔10000个细胞的量将所述对数生长期的人肝癌细胞ifepG2悬液接种入所述8孔细胞板的相应孔中，室温放置30min ; ⑤将所述4个样品分两批按每孔加5yL所述浓度为5mg/mL的样品溶液、每孔加345 μ L所述对数生长期的人肝癌细胞Η印G2悬液的量接种入所述8孔细胞板的相应孔中，并置于所述iCelligence测试台，放入所述培养箱中开始检测；45h后得到两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图；其中纵坐标为细胞指数，横坐标为实时细胞增殖动态效应； ⑥根据所述两张黄绿蜜环菌子抗肝癌标准化组分的活性检测图，当细胞增殖曲线呈现上升平缓或不上升的趋势，则说明细胞分裂减缓或停止，即细胞不能进行正常的分裂，从而确定第Fr8-1号样品和第Fr8-4号样品具有体外抑制人肝癌细胞贴壁及增殖活性。2.如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，其特征在于:所述步骤⑴和所述步骤⑶中减压浓缩的条件是指真空度为0.06?0.09MPa，温度为50?70°C。3.如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，其特征在于:所述步骤⑴中制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为260X50mm ;采用A为正己烷、B为乙酸乙酯的二元流动相体系进行分离:0?15min，100% A?100 % A ; 15?35min,60% A ?60% A ;35 ?50min，0% A ?0% A ;检测波长为 260nm ;上样量为 1.0g。4.如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物的制备方法，其特征在于:制备色谱分离的条件是指色谱柱尺寸为250X20mm;采用A为正己烷、B为乙醇的二元流动相体系进行分离:0?40min，97% A?92% A ;检测波长为260nm ;上样量为0.15 或 0.3g05.如权利要求1所述的一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性留醇类化合物制法所得的活性样品，其特征在于:该活性样品作为有效成分按常规方法与药学上可接受的任何载体制成各类药用制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种黄绿蜜环菌子实体抗肝癌活性甾醇类化合物的制备方法，发明工艺简单、回收率高、重复性较好、质量稳定可控，而且发明以细胞生长曲线为基本指标判定标准化组分和样品对贴壁、繁殖等细胞生理活性的影响，结果直观、易判断；所得到的黄绿蜜环菌子实体抗肝癌甾醇类活性样品(第Fr8-1号样品和第Fr8-4号样品)经NMR氢谱、碳谱分析，分别判定为3β-hydroxy-(22E,24R)-ergosta-5,8,22-trien-7-one和(3α,5α),(8β,11β)-diepidioxy-ergost-22E-en-12-one。
【IPC分类】C12Q1/02
【公开号】CN105255986
【申请号】CN201510588993
【发明人】党军, 王启兰, 陶燕铎, 邵赟, 梅丽娟, 张莉, 崔玉磊
【申请人】中国科学院西北高原生物研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月16日