(3s,6r)-3,6二取代哌嗪-2,5-二酮,其制备及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及了下面结构式所示的小分子U-PA抑制剂，涉及它的制备方法和作为 u-PA抑制剂在抑制肿瘤侵袭和迁移、止血和抗炎方面的应用。本发明属于生物医药领域。
[0002]
【背景技术】
[0003] 纤溶酶原激活系统由纤溶酶原激活剂（Pas)，纤溶酶原激活抑制剂（PAIs)和细胞 外纤溶酶原激活剂受体（PAR)组成。纤溶酶原激活系统涉及细胞迁移，血管生成，伤口愈 合，胚胎发育，肿瘤细胞扩散和转移等一系列过程。在哺乳动物体内主要有组织型纤溶酶原 激活剂（t-PA)和尿激酶型纤溶酶原激活剂（u-PA)两种纤溶酶原激活剂。
[0004] 尿激酶型纤溶酶原激活剂（U-PA)是从人尿或肾细胞组织培养液中提取的一种丝 氨酸蛋白酶，属双链尿激酶型纤溶酶原活化剂（tcu-PA)，分子量为55000或33000,是外源 性纤维溶解系统的激活剂。u-PA可以直接裂解纤溶酶原的精氨酸（560)-缬氨酸（561)肽 键，使无活性的单链纤溶酶原转变为有活性的双链纤溶酶。
[0005] 在肿瘤组织中，u-PA激活纤溶酶原转化为纤溶酶，纤溶酶直接或间接造成细胞外 基质降解，进一步导致肿瘤细胞的浸润，转移和血管生成，促进肿瘤的增殖。在血液循环中， u-PA通过激活纤溶酶原参与调节血管内凝血-纤溶的平衡，对抑制血栓起重要作用。
[0006] 在炎症应答过程中，U-PA通过与炎症细胞表面的U-PAR结合，参与调节炎症细胞 对血管和组织的渗透能力，促进炎症细胞向炎症部位迁移，促进炎症反应以及炎症因子的 释放，而炎症因子的释放又会诱导u-PA表达上升。
[0007] 由于u-PA的酶活性贯穿在肿瘤-纤溶-炎症复杂的交叉联系中，所以影响u-PA 的活性会影响复杂的交叉联系。也就是说，发明优秀活性的u-PA抑制剂对于抑制u-PA在 肿瘤-血栓-炎症交叉联系有重要意义。这种意义体现在70%以上癌症病人死于癌转移； 有大约10%的癌症晚期病人出现出血症状，例如出现几乎无法预测鼻，咽，肺或胃肠道大 出血；摘除肿瘤手术发生的出血，也恶化病人的预后。针对这种状况，本发明提出了（3S， 6S) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮，其制备及治疗作用。
[0008] 此前，发明人曾报道下面结构的二酮哌嗪包括CIPPC是u-PA抑制剂（结构见图 1)，有优秀的止血活性。lnmol/kg剂量下，CIPPC能显著降低小鼠鼠尾出血时间[33,34]。 不幸的是，在l〇nmol/kg剂量下CIPPC能促进血栓生成。血栓是肿瘤本人重要的并合症，是 造成肿瘤本人死亡的重要因素。CIPPC能促进血栓生成的作用为肿瘤病人带来了新的威胁。 对比之下，（3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮的意想不到的优 势是，除了与CIPPC-样有优秀的止血活性外，还有抑制肿瘤细胞浸润和转移，抑制肿瘤本 人并发炎症作用，同时不会引起血栓形成。
【发明内容】
[0009] 本发明的第一个内容是提供下面结构式的u-PA抑制剂（3S，6R)-3_(4-丁氨 基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮；
[0010]
[0011] 本发明的第二个内容是提供（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌 嗪-2, 5-二酮的制备方法，该方法包括下面四个反应步骤：
[0012] (1)在DCC和HOBt存在下L-Trp-〇Bzl在无水四氢呋喃中与L-Boc-Lys(Z)缩合为 D-Boc-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl；
[0013] (2)在氯化氢-乙酸乙酯溶液中D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-OBzl脱去Boc生成 D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl；
[0014] (3)在乙酸乙酯和 5 %NaHC03 存在下D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl生成（3S， 6R)-3-(4-丁氨基苄基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮；
[0015] (4)在Pd/(^PH2存在下，在甲醇中（3S，6R)-3-(4-丁氨基苄基）-6-(吲哚-3-乙 基）-哌嗪-2，5-二酮反应生成（3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2， 5-二酮。
[0016] 上面的四个反应步骤可以用图2的合成路线描述。
[0017] 本发明的第三个内容是评价小分子u-PA抑制剂（3S，6R)-3-(4- 丁氨基）-6-(吲 哚-3-乙基）_哌嗪-2, 5-二酮在抑制肿瘤细胞侵袭和转移方面，以及止血和抗炎等方面的 作用。
【附图说明】
[0018] 图1此前发明人报道的u-PA抑制剂二酮哌嗪CIPPC的结构。
[0019] 图2合成（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮的路线 1.i)DCC,H0Bt,NMM,THF；ii)HCl/EA(4N) ；iii)EA, 5%NaHC03(3a)orEA,TEA, 80°C(3b, 3c)； iv)CH30H,Pd/C,H2。
[0020] 图3 (3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮在体外对UK 激活纤溶酶原活力的影响。其中1列为单组分的人纤溶酶原（PLG)，2列为UK与PLG的 共孵育；3列为100μg(3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和 5μLUK(400U/mL)与 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；4 列为 50μg(3S，6R)-3-(4-丁氨 基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和 5μLUK(400U/mL)与 5μLPLG(5mg/mL)的共孵 育组分；5列为10μg(3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮和5μL UK(400U/mL)与 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；6 列为 500μg的EACA和 5μLUK(400U/ mL)与 5μLPLG(5mg/mL)的共孵育组分；7 列为 250μg的EACA和 5μLUK(400U/mL)与 5μL PLG(5mg/mL)的共孵育组分。
【具体实施方式】
[0021] 为了进一步阐述本发明，下面给出一系列实施例。这些实施例完全是例证性的，它 们仅用来对本发明进行具体描述，不应当理解为对本发明的限制。
[0022] 实施例 1 制备D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-OBzl(1)
[0023] 将1. 9g(5.Ommol)D-Boc-Lys(Z)混悬于20mL无水四氢呋喃，室温搅拌下向溶液中 加入0. 675g(5. 0mmol)H0Bt，冰浴搅拌下加入1. 133g(5. 5mmol)DCC，得到反应液I，冰浴下 搅拌30分钟。将1. 47g(5. 0mmol)L-Trp_0Bzl混悬于20mL无水四氢呋喃中，然后逐渐加入 NMM，调节pH至8-9,得到反应液II。将反应液II加入反应液I中，先在冰浴下搅拌lh，再在 室温搅拌，TLC监测至原料点消失。后处理：减压过滤除去DCU，将滤液减压浓缩除去四氢呋 喃，残留物用150mL乙酸乙酯溶解，将得到的溶液置于250mL分液漏斗中，依次用5%KHS04 水溶液洗和饱和NaCl水溶液各洗3次，乙酸乙酯层用无水Na2S04干燥30min，减压过滤， 滤液减压浓缩至干，得到的黄色泡状物，经硅胶柱层析纯化（CH2C12 :CH30H=100 : 1~ 20 : 1)，得到 2.863g(87.3%)标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :657[M+H] +。
[0024] 实施例 2 制备D-Lys(Z) -L-Trp-〇Bzl(2)
[0025] 将纯品 2. 62g(4.Ommol)D-Boc-Lys(Z) -L-Trp-〇Bzl(1)置于 100mL茄瓶中，冰浴搅 拌下缓慢向反应瓶中滴加30mL4N氯化氢-乙酸乙酯溶液，加干燥管，冰浴搅拌下反应4小 时后TLC监测原料点消失，终止反应。后处理：搅拌下用水泵将反应液减压抽干，加乙酸乙 酯溶解后再次用水泵减压抽干，重复三次；加无水乙醚充分混悬后静置，倾倒出乙醚，抽干 产物，重复三次，得2g(90.9%)标题化合物，为淡黄色粉末。ESI-MS(m/e) :557[M+H] +。
[0026] 实施例3制备（3R，6R)-3-(4-丁氨基苄基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二 酮⑶
[0027] 将1. 83g(3. 29mmol)化合物D-Lys(Z)-L-Trp-〇Bzl⑵以80mL乙酸乙酯溶解，用 三乙胺调pH至9,油浴80°C反应6小时，TLC显示原料点基本消失。后处理：将反应液直接 用硅胶拌样，硅胶柱层析纯化（CH2C12:CH30H= 100:1-20:1)，得到1.28g(86.9%) 标题化合物，为无色固体。ESI-MS(m/e) :449[Μ+Η]+·虫NMR(300MHz，DMS0-d6):δ /ppm= 10. 89(s，1H)，8· 03(s，1H)，7· 85(s，1H)，7· 56(d，J = 9. 0Hz，1H)，7· 35(m，6H)，7· 19(t，J = 6. 0Hz, 1H) ,7. 05(m,2H) ,6. 95 (t, J = 6. 0Hz, 1H) ,4. 99(s,2H) ,4. 07 (s, 1H),3. 25 (dd, J = 3. 0Hz, J = 15. 0Hz, 1H),3. 09 (dd, J = 3. 0Hz, J = 15. 0Hz, 1H),2. 99 (s, 1H),2. 91 (q, J = 6. 0Hz，2H)，1. 48(m，2H)，1. 24(m，2H)，1. 16(m，2H)。
[0028] 实施例4制备（3R，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮（4)
[0029] 将 0. 12g(0. 26mmol)化合物（3R，6S) -3- (4- 丁氨基苄基）-6-(吲哚-3-乙 基）-哌嗪-2,5-二酮（3)置于50mL反应瓶中，加入10mL甲醇溶解，向溶液中加入30mg Pd/C，通入H2，室温搅拌反应48小时，TLC显示原料的基本消失，滤去Pd/C，减压浓缩得 63mg(75% )标题化合物，为无色粉末。ESI-MS(m/e) :315[M+H]+.Mpl89-190°C·IR(KBr): 3250, 2860, 2312,1662,1456,1325,1230,1093,1006,736cm
Ο^Ο?Ο/ΗΜΚΟΟΟΜΗζ,ΟΜΒΟ-?^) :δ/ρρπι= 10.92(s，1H)，8.05(s，1H)，7.88(s，1H)， 7. 56(d,J= 9. 0Hz,lH),7. 31(d,J= 9. 0Hz, 1H), 7. 06 (s, 1H), 7. 04 (t,J= 9Hz,lH), 6. 94(t,J= 9Hz, 1H) ,4. 07 (s, 1H), 3. 26(dd,J= 3Hz,J= 12Hz, 1H), 3. 02(dd,J= 6.OHz,J =15Hz, 1H) ,2. 84(m,2H) ,2. 44(m,2H),1. 19(m,2H),l. 10 (m, 2H).13CNMR(200MHz,DMS0-d6)