： δ/ppm= 168. 60, 168. 09, 136. 37,128. 05, 125. 02,121. 31, 119. 26,118. 85,111. 62, 108. 86, 55. 89,53. 59,41. 05, 31. 94,31. 65, 29. 39, 21. 16.Elem.Anal：C17H22N402.C, 64. 95 ； H，7. 05 ;N，17. 82。
[0030] 实验例1测定（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮对 尿激酶（UK)活性的影响
[0031] 1)主要试剂和仪器
[0032] 试剂：SDS-PAGE凝胶电泳所用试剂及氨基己酸（EACA)均为市售试剂；
[0033] 人纤溶酶原（PLG)和尿激酶（UK)购自Sigma公司。
[0034]仪器：垂直电泳槽Mini-PRORENTetra System(BI0-RAD);
[0035]电泳仪Power Pac(BIO-RAD);
[0036]扫描仪Scanmaker8700(MICROTEK)。
[0037]2)溶液的准备
[0038]PLG溶液的配制：称取PLG5mg，置于15mL离心管中，加入lmL生理盐水溶解即得 PLG溶液，浓度为5mg/mL;分装，每管0.lmL，-20°C保存待用；
[0039]UK溶液的配制：将整瓶UK(100, 000U)以10mL生理盐水溶解，得母液；取0·lmL母 液以生理盐水稀释至2. 5mL，得UK溶液，浓度为400U/mL;分装，每管0.lmL，-20°C保存待 用；
[0040]EACA溶液的配制：称取50mg化合物，以lmL生理盐水溶解，即得母液1，浓度为 50mg/mL;取0. 5mL母液1，以生理盐水稀释至lmL，得溶液2,浓度为25mg/mL;
[0041] (3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮溶液的配制：称取 5mg(3S，6R) -3- (4- 丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮，以lmL生理盐水溶解， 浓度为5mg/mL;-20°C保存待用。
[0042] 3)样品的准备
[0043] 取5μLUK(400U/mL)溶液；分装，每管0.lmL，置于0. 5mL离心管中，再向其中分别 加入10μL生理盐水或（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮溶 液，37°C孵育15分钟；再向各离心管中分别加入5μLPLG溶液，37°C孵育15分钟；孵育结 束后，再向各离心管中分别加入5μL5XSDS电泳上样缓冲液，混匀后将各离心管于100°C 水浴中变性5分钟，快速冰浴冷却后以12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离。
[0044] 4)SDS-PAGE凝胶电泳
[0045] 试剂准备：
[0046] 30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr) 29. 0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis) 1. 0g，混匀后加超 纯水（up-H20)，37°C溶解，定容至100mL，棕色瓶存于室温；
[0047] 1. 5MTris-HCl(ρΗ8· 0) :Trisl8. 17g加up-H20 溶解，浓盐酸调pH至 8. 0,定容至 100mL：
[0048] 1MTris-HCl(pH6. 8) :Trisl2.llg加up-H20 溶解，浓盐酸调pH至 6· 8,定容至 100mL；
[0049] 12% SDS :电泳级SDS12. Og加up_H20于68Γ助溶，浓盐酸调至pH7. 2,定容至 100mL；
[0050] 10%过硫酸铵（八?）：10〇11^八？加即-!120 11111^;
[0051] 考马斯亮兰染色液：甲醇-水-醋酸=45mL+45mL+10mL，加入lOOmg考马斯亮蓝 固体，配制成染色液；
[0052] 脱色液：甲醇-水-醋酸=10mL+90mL+10mL，配制成脱色液。
[0053] 操作步骤：
[0054] 采用垂直式电泳槽装置
[0055] (一）聚丙烯酰胺凝胶的配制
[0056] 1.分离胶（12% )的配制：
[0057]超纯水 4.OmL
[0058] 30 %储备胶溶液3. 3mL
[0059] 1. 5MTris-HC12. 5mL
[0060] 12%SDSO.lmL
[0061] 10%APO.lmL
[0062] 取lmL上述混合液，加TEMED(N，N，N'，Ν' -四甲基乙二胺）10yL封底，余加 TEMED4μL，混匀后灌入玻璃板间，以水封顶，注意使液面平，凝胶完全聚合需大约60min。
[0063] 2.浓缩胶（4 % )的配制：
[0064]超纯水 1. 4mL
[0065] 30 %储备胶溶液0· 33mL
[0066] 1MTris-HClO. 25mL
[0067] 12%SDSO. 02mL
[0068] 10%APO. 02mL
[0069] TEMED2 μ L
[0070] 将分离胶上的水倒去，加入上述混合液，立即将梳子插入玻璃板间，完全聚合需大 约 30min。
[0071](二）样品处理：将样品加入相应量的5XSDS上样缓冲液，KKTC加热3-5min使 蛋白变性，取出，快速降温。
[0072](三）上样：将处理后的样品加入样品池中，并加入20μL蛋白分子量标准品作对 照。
[0073](四）电泳：在电泳槽中加入IX电泳缓冲液，连接电源，负极在上，正极在下，电 泳时，浓缩胶电压80V，30min，分离胶电压100V至电泳至溴酚兰行至电泳槽下端停止（约需 1. 5h)〇
[0074](五）染色：将胶从玻璃板中取出，考马斯亮兰染色液染色,于摇床（60RPM)室温 10min〇
[0075] (六）脱色：将胶从染色液中取出，放入脱色液中，于摇床（60RPM)室温脱色过夜。 [0076](七）将脱色后的胶用扫描仪扫描，观察结果。
[0077] 5)结果见图3,（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮浓 度依赖地抑制UK水解人纤溶酶原的活性。说明它是UK的抑制剂。
[0078] 实验例2测定（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮对 HCCLM3细胞侵袭能力的影响
[0079] 1)受试样品
[0080] (33,6幻-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮用含0.1%0130 的DMEM培养基配制成50μΜ浓度；
[0081]RGDS用含0. 1%DMS0的DMEM培养基配制成100μΜ浓度。
[0082] 2)细胞株
[0083]HCCLM3(高转移人肝癌细胞），购自ATCC。
[0084] 3)主要仪器及耗材
[0085] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
[0086] 细胞孵育箱：INC153,memmer公司；
[0087] 显微镜：Zeiss公司；
[0088] 8. 0μm孑匕径的Transwell小室、12孑L细胞培养板和25cm2培养并瓦：Coming Costar 公司。
[0089] 4)主要试剂
[0090] DMEM培养基干粉：Gibco公司；
[0091]PBS缓冲液：每 1L溶液中含有NaC18. 2g、KC10. 2g、Na2HP04 ·Η201· 56g、KH2P040 . 2g， PH值 7· 4;
[0092] 胎牛血清：Hyclone公司；
[0093] 0· 25%胰酶溶液：Hyclone公司；
[0094] 青霉素、链霉素：石药集团中诺药业（石家庄）有限公司；
[0095] DMS0 (二甲基亚讽）：Hyclone公司；
[0096] Matrigel (基质胶）：BD公司；
[0097] 结晶紫染液：碧云天公司。
[0098] 5)评价方法
[0099] 包被基质胶：将冻存于-20°C冰箱的matrigel4°C过夜，变成液态；取720μL无 血清DMEM培养基，加入180μLMatrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100μL/个；放入37°C、5%C02培养箱中，孵育5h;
[0100] 水化基底膜：吸除小室中残留液体，每孔加入50μL的DMEM培养基，37°C、5%C02 培养箱中孵育30min;
[0101] 接种细胞：消化HCCLM3细胞，无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液， 密度为5X105个/mL;每孔加入100yL细胞悬液，同时加入25 基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮使终浓度为10μM，RGDS终浓度为20μΜ;下室 加入600μL的含10%FBS的DMEM培养基，在37°C、5%C02培养箱中培养48小时；
[0102] 结晶紫染色：用棉签擦去基质胶和上室内的细胞；用4%的多聚甲醛固定细胞30 min，吸除固定液，用PBS洗3次；用0. 1 %的结晶紫染液染色30min，吸除染色液，用PBS洗 3次；
[0103] 计数：在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数；实验数据统计均采 用t检验和方差分析，细胞数以G±sd个）表示。
[0104] 6)结果见表1，（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮能 有效地抑制HCCLM3细胞侵袭。
[0105] 表 1. (3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2,5-二酮对此010细 胞侵袭能力的影响a
[0108] a)n= 3 ;b)与生理盐水比P< 0· 05.
[0109] 实验例3评价（3S，6R)-3-(4-丁氨基）-6-(吲哚-3-乙基）-哌嗪-2, 5-二酮对 HCCLM3细胞迁移能力的影响
[0110] 1)受试样品
[0111] 化合物4用含0. 1 %DMS0的DMEM培养基配制成50μΜ浓度；
[0112] RGDS用含0. 1 %DMS0的DMEM培养基配制成100μΜ浓度。
[0113] 2)细胞株
[0114] HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0115] 3)主要仪器及耗材
[0116] 超净台：VS-1300-U洁净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；
[0117] 细胞孵育箱：INC153,memmer公司；
[0118] 显微镜：Zeiss公司；
[0119] 8. 0μm孑匕径的Transwell小室、12孑L细胞培养板和25cm2培养并瓦：ComingCostar 公司。
[0120] 4)主要试剂
[0121] DMEM培养基干粉：Gibco公司；
[0122] PBS缓冲液：每 1L溶液中含有NaC18. 2g、KC10. 2g、Na2HP04 ·Η201· 56g、KH2P040 . 2g， PH值 7·