一种酶法不对称还原制备(S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物制药和生物化工技术领域，具体涉及一种酶法不对称还原制备 (S) -N-boc-3-羟基哌啶的方法。
【背景技术】
[0002] 哌啶酮及其衍生物是非常重要的哌啶同系物，利用哌啶酮结构中的羰基的活性可 以引发许多有机反应。其衍生物已经被发现具有抗菌、抗肿瘤、治疗老年痴呆症和麻醉等多 种药理活性，同时也是治疗病毒感染（包括AIDI)及糖尿病的重要药物之一（Shen，W.，et al. ,Synthesisof(S)-l-Boc-3-hydroxypiperidine.ChineseJournalofPharmaceutica Is, 2013. 44(5) :p. 436-438.) 〇
[0003] 以（S)-N-boc-3-羟基哌啶为例，（S)-N-boc-3-羟基哌啶可以 用于合成一种非天然药物抗充血性心力衰竭药卡莫瑞林（Carpino,P. A. ,etal. ,Pyrazolinone-piperidinedipeptidegrowthhormone secretagogues(GHSs):Discoveryofcapromorelin.Bioorganic&MedicinalChemis try，2003. 11 (4) :p. 581-590.)、BTK抑制剂ibrutinib(Advani，R.H.，etal·，Bruton TyrosineKinaseInhibitorIbrutinib(PCI-32765)HasSignificantActivityin PatientsWithRelapsed/RefractoryB-CellMalignancies.JournalOfClinical Oncology，2013. 31 (1) :p. 88-94.)、天然物质异白刺P林淋胺（isonitramine)和小果白 刺喊（sibirine)等药物前体（Snider，Β·B.andC.P.Cartayamarin，TOTALSYNTHESIS OF(+/-)-NITRAMINE-DEVELOPMENTOFAKETENEEQUIVALENTINTHEENEREACTION. JournalOfOrganicChemistry，1984. 49 (10) :p. 1688-1691.)，因此该化合物具有广泛的 应用前景。
[0004] 迄今为止，关于（S)-N-boc-3-羟基哌啶的合成已进行了很多的研究报道。主 要分为化学转化法和生物催化法。化学转化的方式因其催化剂价格昂贵、反应条件苛 亥[J、收率低、合成步骤繁琐，并且产生的三废较多，没有能够实现工业化应用（Reddy，A. S. ,M.Narender,andK.R.Rao,Anewasymmetricsyntheticroutetosubstituted piperidines.Tetrahedron，2007. 63(2) :p. 331-336.)。生物催化法不对称还原N-boc-3-哌 啶酮制备（S)-N-boc_3-羟基哌啶的技术有一定进展。Lacheretz等（Lacheretz，R.，D. G.Pardo,andJ.Cossy,DaucuscarotaMediated-ReductionofCyclic3-0x0-amines. OrganicLetters，2009. 11 (6) :p. 1245-1248.)利用胡萝卜组织细胞还原N-boc-3-哌啶酮 制备出95%光学纯的（S)-N-boc-3-羟基哌啶。该反应由于催化剂来源不稳定底物浓度 低（3mM)、催化剂使用量大（23%，m/v)、收率低（73% )且光学纯度较低（95%ee)，不具 有工业应用价值。XinJu等（Ju，X.，etal·，DevelopmentofaBiocatalyticProcess toPrepare(S)-N-Boc-3-hydroxypiperidine.OrganicProcessResearch&Developmen t，2014. 18(6) :p. 827-830.)筛选到了一条依赖于NADH的酮还原酶，在大肠杆菌表达，并 添加适量的辅酶NAD、辅底物异丙醇及适量助溶剂IPA后，利用底物耦合的辅酶循环系统， 分批添加总量为5g的底物，在50ml的水相反应体系中经过24h反应，摩尔转化率达到 99. 8%，（S)-N-boc-3-羟基哌啶收率和化学纯度分别为97. 6%和93%。虽然该方法产物 光学纯度不高，但是可以确定利用先进的重组酶技术能够开发出具备工业化参数标准的 (S) -N-boc-3-羟基哌啶生物催化制备工艺。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供一种酶法不对称还原制备（S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法， 首次将NCBI上的收录号为AGG35486. 1的醇脱氢酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备
[5] -N-boc-3-羟基哌啶，转化率高，产物光学活性高，大大降低了生产成本。
[0006] 为达到上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
[0007] -种酶法不对称还原制备（S)-N-boc-3-羟基哌啶的方法，以氨基酸序列如SEQID NO:2所示的醇脱氢酶为催化剂，以N-boc-3-哌啶酮为底物，NADH为辅酶体系，不对称还原 制备（S)-N-boc-3-羟基哌啶。
[0008] 反应体系中，N-boc-3-哌啶酮的浓度为15~220g/L，醇脱氢酶活性为5. 6lV(mg protein)，用量为 60U~6000U〇
[0009] 反应条件为ρΗ6· 0~7. 5、20~35°C、180~280rpm条件下反应1~12h。优选反 应条件为pH7. 0、30°C、200rpm条件下反应6h。
[0010] 所述NADH辅酶体系为NAD+的浓度为0. 05~0. 5mmol/L，异丙醇13. 5~198g/L。
[0011] 所述NADH辅酶体系为NAD+、甲酸钠和甲酸脱氢酶混合体系。
[0012] 所述NADH辅酶体系为NAD+、葡萄糖和葡萄糖脱氢酶混合体系。
[0013] 所述的醇脱氢酶是通过表达含有基因序列如SEQIDN0:1所示的重组菌得到的。
[0014] 本发明中涉及到的还原酶是醇脱氢酶，其包含336个氨基酸，其在NCBI上的收录 号为：AGG35486. 1，其氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。编码该蛋白的基因含有lOllbp碱 基，其在NCBI中的收录号为KC236900. 1，其核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。至今未发现 该酶用于N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备（S)-N-boc-3-羟基哌啶醇的报道。
[0015] 本发明中所用催化剂为氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示的醇脱氢酶，可以以任意 形式参与反应，比如，将基因导入到受体菌中表达得到醇脱氢酶参与反应，或者直接将发酵 后的菌泥参与反应。
[0016] 将基因序列如SEQIDN0:1所示的醇脱氢酶诱导表达后，与15~220g/L的 N-boc-3-哌啶酮、13. 5 ~198g/L的异丙醇和 0. 05 ~0. 5mmol/L的NAD+，在pH6. 0 ~7. 5、 20~35°C、180~280rpm条件下反应1~12小时，得到（S)-N-boc-3-羟基哌啶。其中，加 入的NAD+与异丙醇在醇脱氢酶作用下生成NADH，使反应循环进行，降低了加入量以减少生 产成本。
[0017] 发明人发现来源于白色念珠菌Candidaalbicans的醇脱氢酶在水相中能够高效 催化N-boc-3-哌啶酮为（S) -N-boc-3-羟基哌啶，e.e值为100%。同时，通过在水相和水 /有机相中反应中反应条件的优化，提高了转化效果，发现了该条基因催化N-boc-3-哌啶 酮为高立体选择性的（S)-N-boc-3-羟基哌啶的新功能。催化体系中引入辅酶循环体系帮 助辅酶再生，降低了辅因子的加入量以减少生产成本。
[0018] 有益效果：本发明首次将氨基酸序列如SEQIDN0 :2所示的醇脱氢酶应用于 N-boc-3-哌啶酮不对称还原制备（S)-N-boc-3-羟基哌啶中，取得很好的效果，其对底物N-boc-3-哌啶酮的转化率高（99. 34% )，产物（S)-N-boc-3-羟基哌啶的光学活性高（e.e 为100% )，且产量高，大大降低了生产成本。
[0019] 本发明的酶法不对称还原制备（S) -N-boc-3-羟基哌啶方法与其他制备方法相比 还有如下优点：
[0020] 1、反应体系简单、反应时间短，产物得率和对映体过量值高；
[0021] 2、本发明中的生物催化剂底物耐受性好，无需分批投料可实现高底物浓度下的催 化反应；
[0022] 3、催化体系中引入辅酶循环体系帮助辅酶再生，降低了辅因子的加入量以减少生 产成本。
【附图说明】
[0023] 图1为本发明的一种合成路线；
[0024] 图2为实施例2中，反应lh取样所得样品的GC图谱；
[0025] 图3为实施例2中，反应6h取样所得样品的GC图谱。
【具体实施方式】
[0026] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书所详细描述的本发明。