专利名称：一种微生物不对称还原制备(r)－扁桃酸的方法
技术领域：
一种微生物不对称还原制备(R)-扁桃酸的方法，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。
背景技术：
外消旋扁桃酸(又称为α-羟基苯乙酸，英文名Mandelic acid)，是由(R)-扁桃酸和(S)-扁桃酸两个对映体构成，其中(R)-扁桃酸是一种重要的手性中间体，被广泛应用于多种药物的合成，如被用于合成青霉素和头孢菌素等抗生素、减肥药物、抗肿瘤药物、治疗抑郁症药物和农药等；并可作为手性试剂，用于拆分其它手性化合物。
手性化合物在人们生活中具有重要作用，由于两个对映体在药理、毒理及功能作用等各方面均有所不同，因此，制备光学纯的手性模块化合物在医药、农业、材料和环保等领域都具有广泛的价值。
扁桃酸的化学结构为 传统的化学工业拆分法，主要是利用旋光性胺类化合物，如α-甲基苄胺、(-)-麻黄碱和辛可宁等，通过非对映(立体)异构盐形成法，得到单一对映体，由于反应中所添加的手性拆分剂价格昂贵且均具有毒性，会对环境造成危害，因此利用生物法转化光学纯扁桃酸就成为研究的热点。
目前，国际上拆分外消旋化合物常见方法主要包括色谱法、化学法和生物法等。
其中，制备手性色谱柱进行拆分法，被分离样品可变范围窄，需昂贵的手性添加剂，因此仅限于检测及实验室制备；化学法收率低、光学纯度低、生产工序繁杂、能耗大、成本高、毒性大、环境污染严重；利用生物法转化制备光学纯的手性化合物具有反应条件温和，产物单一，立体选择性、区域选择性和化学选择性较高，并能完成一些化学合成难以进行的反应等优点。合成光学活性物质的生物转化反应大致可分为两类一类是把外消旋体拆分为两个具有光学活性的对映体；另一类是从非手性或潜手性的前体出发，通过催化反应得到不对称的光学活性产物。
90年代起国际上对微生物及酶拆分手性化合物进行大量的研究。酶由L-氨基酸构成，其活性中心构成了一个不对称环境，有利于对消旋体的识别，是一种高度手性的催化剂。其催化效率高，有较强的专一性。利用微生物体内含有的高度立体选择性活性酶作催化剂，直接转化手性合成前体或非手性的起始物，经酶的催化合成手性化合物，很多情况下，可将前体100％转化成手性目标产物，因此选择性生物催化合成已成为合成手性化合物最有前景的方法之一，适用于大规模的工业生产。传统发酵，固定化细胞，固定化酶以及有机溶媒和双水相转化等技术，使选择性生物催化能适用于各种规模的工业生产。
目前国际上已报道的制备(R)-扁桃酸的生物方法主要有Yadav等利用脂肪酶在非水相中不对称水解扁桃酸甲酯制备(R)-扁桃酸，但水解率达到19％时，光学纯度仅为78％。
Kaul等利用腈水解酶不对称水解扁桃腈制备(R)-扁桃酸，但产率最高只能达到50％，且产物与底物较难分离。
0da等以1，2-苯乙二醇为底物，通过不对称氧化β-羟基而得到(R)-扁桃酸，但得率仅为40％，且副产物较多，且较难分离。
Yamazaki等利用苯乙酮酸脱氢酶催化不对称还原，但反应需在体系中加入辅酶(NADH)。
发明内容
(1)要解决的技术问题本发明的目的是提供一种微生物不对称还原制备(R)-扁桃酸的方法。本发明目的不仅仅在于制备高光学纯度的扁桃酸，而是通过筛选寻找不同于以往研究的新菌种，从而考察在合成手性化合物方面微生物菌种的多样性。进而比较不同菌种在转化途径及反应机理上的差别。
(2)技术方案本发明首先从微生物出发，筛选能够高效转化苯甲酰甲酸成手性扁桃酸的菌种。在此基础上，对该菌种的培养条件及不对称转化的反应条件进行优化，并考察了细胞稳定性和转化方式。
设计该转化方法的途径如下 主要试剂苯甲酰甲酸购于英国Lancaster公司
(R)-扁桃酸，(S)-扁桃酸，苯甲酰甲酸购于美国Fluka公司(R)-扁桃酸和(S)-扁桃酸分析方法的确定(R)-扁桃酸、(S)-扁桃酸、苯甲酰甲酸标样在Chiralcel OD-H柱上通过手性固定相高效液相色谱(CSPHPLC)进行分析，苯甲酰甲酸的保留时间为9.5min，(S)-扁桃酸的保留时间为15.9min，(R)-扁桃酸的保留时间为19.6min。所用高效液相色谱仪为HP1100，紫外检测器，手性柱Chiralcel OD-H(250×4.6mm)购于日本Daicel Chemical Ind.，Ltd.
确定具体色谱条件为手性柱Chiralcel OD-H柱(4.6×250mm)，流动相体积比为正己烷∶异丙醇∶三氟乙酸＝90∶10∶0.1，流速为0.5mL/min，柱温18℃，柱压 常压；检测波长UV 225nm，进样量5μl。
产物(R)-扁桃酸的光学纯度通过对映体过量值(％e.e.)来评价对映体过量值(％e.e.)＝[(SS-SR)/(SS+SR)]×100％(R)-扁桃酸得率(％)＝(CR/C0)×100％式中SS为反应后(S)-对映体的峰面积，SR为反应后(R)-对映体的峰面积，CR为反应后体系中的(R)-扁桃酸摩尔浓度，C0为初始苯甲酰甲酸的摩尔浓度。
一、微生物的确定经过对实验室保藏的包括细菌、酵母和霉菌等大量微生物进行筛选，从所得转化产物的光学纯度和产率两个方面考虑，选定一株菌种为催化转化反应用的出发菌株酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.150，产物(R)-扁桃酸，光学纯度为85～100％e.e.，产率60～100％。
二、菌株的培养和产酶条件优化培养基成分优化分别考察了碳源、氮源、磷源对转化及菌体量的影响，并经过正交实验最终确定出发菌株酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150培养基组成为(g/100ml)葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O0.02～0.06，NaCl 0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，FeSO4·7H2O0.001～0.005，CuSO4·5H2O 0.0001～0.0005，MnSO4·4H2O 0.00025～0.001。
培养条件优化分别考察了起始pH、装液量、温度、培养时间对转化及菌体量的影响。
最终确定了出发菌株酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150培养条件为起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
优化后，酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率为80～100％。
三、全细胞催化不对称还原反应体系及反应条件的优化菌种的培养及转化用细胞的制备酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150接种在装液量体积分数为5％～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时。培养结束后，将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于转化反应。
微生物细胞的催化转化反应酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150全细胞催化转化反应条件为催化转化反应在0.2mol/L的磷酸钾缓冲溶液中进行，菌体细胞溶于其中，细胞的重量/体积浓度为5％～30％，底物苯甲酰甲酸的重量/体积浓度为0.25％～5％，辅助底物葡萄糖的重量/体积浓度为0.25％～10％，反应体系pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，100～300rpm振荡反应，反应时间24～72小时。
考察了不同辅助底物的转化酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150全细胞催化转化反应条件为细胞重量/体积浓度5％～30％(W/V)，底物重量/体积浓度0.25％～5％(W/V)，反应pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，反应时间24～72小时。
添加重量/体积浓度为0.25％～10％的不同辅助底物，如葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇、甲酸铵等。
考察了在转化体系中添加金属离子对转化的影响添加0.5～5mmol/L的各种金属离子，包括Al，Ag，Ba，Ca，Cd，Co，Cu，Fe，Hg，La，Li，Mg，Mn，Zn等，发现部分金属离子的存在有助于提高转化效率，如Al，Ca，Co，Pb等，而其它离子作用不明显或有抑制作用，最终转化产物(R)-扁桃酸的光学纯度为95～100％e.e.，收率85～100％。
考察了酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150全细胞催化转化的稳定性酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150全细胞催化转化反应条件为细胞重量/体积浓度5％～30％(W/V)，底物重量/体积浓度0.05％～10％(W/V)，反应pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，辅助底物葡萄糖浓度0.5～5％，反应时间24～72小时。一次转化结束后，离心收集菌体，继续进行第二次转化，上清用于检测，依次重复进行转化，可连续转化2～20批次，2～50天，均能保持产物(R)-扁桃酸的光学纯度为90～100％e.e.，收率在60～100％。
生物材料样品来源所用菌种酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。
(3)有益效果本发明通过筛选得到一株转化效果较好的菌株酿酒酵母Saccharomycescerevisiae AS 2.150。
用该菌株进行不对称还原苯甲酰甲酸得到产物(R)-扁桃酸，光学纯度均为90％e.e.以上。
经培养基组成和培养条件优化后，所用菌株不对称还原苯甲酰甲酸，产物(R)-扁桃酸光学纯度有所提高，确定了优化的培养基组成和培养条件。
确定了该菌全细胞不对称还原苯甲酰甲酸的反应体系及反应条件。
研究了该菌转化过程、转化体系中添加金属离子和不同辅助底物的因素对转化的影响，并考察了菌体转化的稳定性，提高了转化效率。
这些工作有助于了解不对称合成手性化合物的生物多样性，对于今后合成手性化合物专用酶源的开发和不对称合成方法的研究具有较为重要的意义。
具体实施例方式
实施例1菌株的培养培养基组成为每100ml培养液所含组分以g计葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O 0.02～0.06，NaCl 0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，FeSO4·7H2O 0.001～0.005，CuSO4·5H2O 0.0001～0.0005，MnSO4·4H2O 0.00025～0.001。
培养条件为起始pH6.0～8.0，装液量20％，培养温度30℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间48小时。
实施例2全细胞的制备酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150接种在装液量为20％的250ml摇瓶中于30℃、100～300rpm振荡培养48小时；培养结束后将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于转化反应。
实施例3称取0.1g(5％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含5mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.0的2mL磷酸钾缓冲液中，加入0.01g葡萄糖，40℃，150转/分，转化24小时，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度99.89％e.e，产率84.96％。
实施例4称取0.3g(15％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含20mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，加入0.04g葡萄糖，25℃，150转/分，转化72小时，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度98.57％e.e，产率90.46％。
实施例5称取0.6g(30％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含100mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，加入0.2g葡萄糖，33℃，150转/分，转化48h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度99.91％e.e，产率64.79％。
实施例6称取0.2g(10％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含10mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，加入2％(V/V)乙醇，30℃，150转/分，转化48h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度96.28％e.e，产率94.84％。
实施例7称取0.2g(10％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含20mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，加入0.03g葡萄糖，加入3mmol/L CoCl2，30℃，150转/分，转化48h，离心转化液，收集上清，用3mol/L盐酸调节pH至1.0，再用2.5倍体积的乙酸乙酯萃取，分离出的乙酸乙酯层用无水硫酸钠除水，低温真空干燥，将残余固体用正己烷和异丙醇的混合液(体积比为9∶1)溶解，产物(R)-扁桃酸光学纯度99.34％e.e，产率94.67％。
实施例8称取0.3g(15％)酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150菌体细胞，置于含10mg苯甲酰甲酸的0.2mol/L、pH7.5的2mL磷酸钾缓冲液中，再向转化液中加入0.04g葡萄糖，30℃，150转/分，转化48小时，离心转化液，收集菌体，按上述方法重复转化试验。连续转化至11批，收集上清，测得产物(R)-扁桃酸光学纯度98.74％e.e，产率81.92％。
权利要求
1.一种微生物法不对称还原制备(R)-扁桃酸的方法，其特征是出发菌株采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)AS 2.150，经过菌株的培养，全细胞的制备，以苯甲酰甲酸为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，进行微生物细胞的催化转化反应催化转化反应在0.2mol/L的磷酸钾缓冲溶液中进行，菌体细胞溶于其中，细胞的重量/体积浓度为5％～30％，底物苯甲酰甲酸的重量/体积浓度为0.25％～5％，辅助底物葡萄糖的重量/体积浓度为0.25％～10％，反应体系pH值6.0～8.0，反应温度25～40℃，100～300rpm振荡反应，反应时间24～72小时。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征是菌株的培养培养基组成为每100ml培养液所含组分以g计葡萄糖2～6，酵母膏0.25～1，(NH4)2HPO40.5～2.0，KH2PO40.1～0.5，MgSO4·7H2O 0.02～0.06，NaCl0.0025～0.01，ZnSO4·7H2O 0.001～0.005，FeSO4·7H2O 0.001～0.005，CuSO4·5H2O0.0001～0.0005，MnSO4·4H2O 0.00025～0.001；培养条件为起始pH6.0～8.0，装液量体积分数为5％～30％，培养温度25～35℃，摇瓶转速100～300rpm，培养时间24～72小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征是全细胞的制备酿酒酵母S.cerevisiae AS 2.150接种在装液量体积分数为5％～30％的250ml摇瓶中于25～35℃、100～300rpm振荡培养24～72小时；培养结束后将发酵液中的菌体离心并用生理盐水洗涤两次，将收集的细胞保藏在4℃冰箱中用于转化反应。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征是选择的辅助底物还包括添加重量/体积浓度为0.25％-10％的葡萄糖、甘油、乙醇、甲酸、异丙醇、仲丁醇或甲酸铵。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征是在催化转化反应的转化体系中添加0.5～5mmol/L的Al，Ca，Co或Pb金属离子有助于提高转化效率。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征是转化用的菌体能重复使用2～20次。
全文摘要
一种微生物法不对称还原制备(R)－扁桃酸的方法，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明筛选得到酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae AS2.150，利用该菌株经过培养，全细胞制备，以苯甲酰甲酸为底物进行微生物细胞的催化转化反应，在加入辅助底物情况下，不对称还原苯甲酰甲酸得到产物(R)－扁桃酸，产物的光学纯度达到90％e.e.以上。本发明确定了该菌株全细胞不对称还原苯甲酰甲酸的反应体系和反应条件，其产物的光学纯度和收率得到提高；本发明还有助于了解不对称合成手性化合物的生物多样性，对于今后生物催化专用酶源的开发和手性化合物合成方法的研究具有较为重要的意义。
文档编号C12N1/14GK1840670SQ200610037940
公开日2006年10月4日 申请日期2006年1月18日 优先权日2006年1月18日
发明者徐岩, 张辉 申请人:江南大学