得到细胞的表观遗传的信息的方法、判断细胞的特性的方法、判断药剂感受性的或选择药 ...的制作方法
【专利说明】得到细胞的表观遗传的信息的方法、判断细胞的特性的方 法、判断药剂感受性的或选择药剂或免疫疗法剂的种类的 方法、疾病的诊断方法、以及自我复制载体、测定试剂盒及 分析装置 【技术领域】
[0001 ] 本发明的实施方式涉及得到细胞的表观遗传的信息的方法、判断细胞的特性的方 法、判断药剂感受性的或选择药剂或免疫疗法剂的种类的方法、疾病的诊断方法、以及自我 复制载体、测定试剂盒及分析装置。 【【背景技术】】
[0002] 在基因的表达与多种因子相关。由那样的因子的存在或不在或者存在的量的变化 而对象的健康状态被左右。另外，如果观察那样的因子的状态，则判断对象中的健康状态变 得可能。
[0003] 在关于基因的表达的因子中，有伴随构成基因组的DNA的碱基序列的变化的和不 伴随DNA碱基序列的变化的。在伴随DNA的碱基序列的变化的中含多型或变异。另一方面， 不伴随DNA碱基序列的变化的有关于表观遗传控制的变化。关于这样的多型及变异、以及 表观遗传控制的信息（即，表观遗传的信息）在医疗、农业、渔业等的各种各样的领域中有 用。在表观遗传的信息中有DNA的修饰、组蛋白的化学修饰、由非翻译性RNA的控制等。
[0004] 例如，目前报告，得到对特定的碱基序列的甲基化等的修饰的有无或修饰量的变 化等的表观遗传的信息对于医学有用。
[0005] 关于DNA的甲基化的信息是有用的表观遗传的信息的1例。DNA甲基化异常在多 阶段的发癌过程中自早期被确认。另外，在初期肝癌中也确认目标基因群集中的甲基化。
[0006] 基因组DNA的甲基化反应是指在细胞内由DNA甲基转移酶在基因组上的胞嘧啶附 加甲基。细胞分裂时基因组复制，则复制的基因组在与复制前的基因组同位置的胞嘧啶发 生甲基的附加。
[0007] 现在，在检测DNA的甲基化的手段中，例如，有硫酸氢盐处理PCR法、测序法、利用 报告子载体的方法。例如，作为利用报告子载体的方法，报告有测定由时钟基因的DNA甲基 化的昼夜节律控制结构，筛选昼夜节律障碍改善剂的方法。所述筛选法是制作染色体上整 合在细胞内甲基化的已知的目标核酸序列的稳定表达细胞株，利用与细胞分裂时的基因组 复制同时进行的甲基化反应，筛选昼夜节律障碍改善剂的方法。
[0008] 【现有技术文献】
[0009] 【专利文献】
[0010] 专利文献1 :特开2009-232761号公报
[0011] 专利文献2 :特开2012-60894号公报
[0012] 【非专利文献】
[0013]非专利文献 1 :Y〇shiuraKetal.，ProcNatlAcadSciUSA. 1995, 92, 7416-7419。
[0014] 非专利文献 2:ChenYLetal.，BiochemBiophysResCommun. 2012， 425(2),290-296
[0015] 非专利文献 3:HayatsuHetal. ,Biochemistry. 1970, 9, 2858-2865。
[0016] 非专利文献 4 :GonzalgoMLetal· ,NucleicAcidsRes. 1997, 25, 2529-2531。
[0017] 非专利文献 5 :HermanJGetal·,ProcNatlAcadSciUSA.lggejSJSSl-
[0018] 非专利文献 6 :ClarkSJetal· ,NucleicAcidsRes. 1994, 22, 2990-2997。
[0019] 非专利文献 7 :FrommerMetal· ,ProcNatlAcadSciUSA. 1992, 89, 1827- 1831。
[0020] 非专利文献 8:WarneckePMetal· ,Methods. 2002, 27, 101-107。 【
【发明内容】
】
[0021] 【发明要解决的技术课题】
[0022] 实施方式旨在提供简便地得到细胞的表观遗传的信息的方法。
[0023]【解决课题的技术方案】
[0024] 由实施方式提供得到细胞的表观遗传的信息的方法。此方法包括：将报告子核酸 构建体导入被检细胞的核内，使报告子核酸构建体自我复制，检测在被检细胞中发生的信 号的有无及/或大小，基于得到的结果，得到被检细胞的表观遗传的信息。报告子核酸构建 体的特征在于，将被检细胞的基因组上的特定的序列中的修饰的状态抄录到在被检细胞的 核内的自我复制中由官能团的取代而对应的其序列上，依赖于抄录的官能团的存在状况发 生可检测的信号。 【【附图说明】】
[0025] 【图1】图1是显示自我复制载体的1例的图。
[0026] 【图2】图2是显示自我复制载体的1例的图。
[0027] 【图3】图3是显示自我复制载体的1例的图。
[0028] 【图4】图4是显示自我复制载体的例的图。
[0029] 【图5】图5是显示自我复制载体的例的图。
[0030] 【图6】图6是显示自我复制载体的1例的图。
[0031] 【图7】图7是显示自我复制载体的1例的图。
[0032] 【图8】图8是显示得到细胞的表观遗传的信息的方法的1例的方案。
[0033] 【图9】图9是显示得到细胞的表观遗传的信息的方法的1例的方案。
[0034] 【图10】图10是显示得到细胞的表观遗传的信息的方法的1例的方案。
[0035] 【图11】图11是显示得到细胞的表观遗传的信息的方法的1例的方案。
[0036] 【图12】图12是显示判断被检细胞的特性的方法的1例的图。
[0037] 【图13】图13是显示用于进行得到细胞的表观遗传的信息的方法的分析装置的框 图。
[0038] 【图14】图14是显示含甲基化目标序列的自我复制载体的制作工序的1例的图。
[0039] 【图15】图15是显示实验结果的坐标图。
[0040] 【图16】图16是显示含CK19启动子区域和复制起始序列的自我复制载体的图。
[0041] 【图17】图17是显不复制起始蛋白质基因表达载体的图。
[0042] 【图18】图18是显示CK19启动子区域的CCGG序列的位置的图。
[0043] 【图19】图19是显示实验结果的图。
[0044] 【图20】图20是显示实验结果的图。
[0045] 【图21】图21是显示实验结果的图。
[0046] 【图22】图22是显示实验结果的图。
[0047] 【图23】图23是含C0X2启动子区域和复制起始序列的自我复制载体的图。
[0048] 【图24】图24是显示C0X2启动子区域的CCGG序列的位置的图。
[0049] 【图25】图25是显示实验结果的图。
[0050] 【图26】图26是显示实验结果的图。
[0051] 【图27】图27是显示实验结果的图。
[0052] 【图28】图28是显示实验结果的图。
[0053] 【图29】图29是显示实验结果的图。
[0054] 【图30】图30是显示实验结果的图。
[0055] 【图31】图31是显示实验结果的图。
[0056] 【图32】图32是显示荧光素酶测定的结果的图。
[0057] 【图33】图33是显示含甲基化目标序列的自我复制载体的制作方法的1例的图。
[0058] 【图34】图34是显示向细胞的2种载体的共转染的模式图。
[0059]【图35】图35是显示自我复制载体的1例的图。
[0060]【图36】图36是显示实验结果的图。
[0061] 【实施方式】
[0062] 以下，对于本发明的实施方式详细地进行说明。
[0063] 根据实施方式的得到细胞的表观遗传的信息的方法使用可自我复制的报告子核 酸构建体。此报告子核酸构建体在被检细胞的核内自我复制时，将被检细胞的基因组中的 特定的序列上的修饰的状态抄录到自身的序列。即，报告子核酸构建体含与要观察的特定 的序列相同的序列。再者，由自我复制，基因组的特定的序列上的修饰状态被抄录（拷贝） 到与报告子核酸构建体中的其相同的序列上。报告子核酸构建体依赖于抄录到所述报告子 核酸构建体的官能团的存在状况，发生可检测的信号。此时、由官能团的存在状况而信号的 有无或大小或量不同。由此，报告子核酸构建体报告基因组的特定的序列上的修饰状态。 [0064] 报告子核酸构建体的报告功能通过报告子核酸构建体自我复制而初始得到。从 而，报告子核酸构建体被导入置于报告子核酸构建体的自我复制开始的条件的被检细胞的 核内。然后，在经过对于被导入被检细胞的核内的报告子核酸构建体自我复制必要时间后， 在被检细胞内检测报告子核酸构建体发生的信号。信号的检测可对于信号的有无进行，也 可对于信号的大小或量进行。由检测得到的结果是被检细胞的表观遗传的信息。其中，"细 胞的表观遗传的信息"可为对于对构成被检细胞的基因组上的特定的序列的碱基是否结合 有官能团、是否有取代等的信息。其中"可检测的信号"可为荧光、发光及呈色等，或者也可 为蛋白质等的物质的呈示。或者其是，例如，可由本领域公知的方法检测的信号即可。另 外，所述信号依赖于抄录到报告子核酸构建体的官能团的存在状况，其提示的有无或大小 改变。
[0065]"报告子核酸构建体"是指用于报告要试验的细胞的表观遗传的信息的核酸构建 体。以下描述对于报告子核酸构建体和基因组的特定序列中的修饰的相关的例。以下的例 是表观遗传的信息是关于基因组的特定的序列中的甲基化的信息时的1例。表1示报告子 核酸构建体的报告子活性和甲基化的相关。
[0066]【表1】
[0067]
[0068] 表1所示的相关是报告子核酸构建体的信号由报告子核酸构建体的对应的序列 的脱甲基化变大，由甲基化变小的1例。
[0069] 此报告子核酸构建体，例如，可在癌的检测中使用。在癌细胞的情况中，在基因组 上的特定的序列中发生脱甲基化。
[0070] 这样的细胞中的表观遗传的信息在其自我复制时，被抄录到报告子核酸构建体中 所含的对应的序列。例如，将报告子核酸构建体的对应的序列预先甲基化，则在自我复制时 发生脱甲基化。此时、自报告子核酸构建体的可检测的信号变大。例如，以这样的大的信号 的检测作为指标，检测癌变得可能。其中，"对应的序列"是指与基因组上的特定的序列、即 要检测的修饰所在的序列相同的序列。
[0071] 例如，准备含多个甲基的报告子核酸构建体（A-1)。设基因组上的特定的序列含多 个甲基（A-2-1)。此时，当自我复制时，所述构建体中无官能团的取代，或者少（A-3-1)。此 时，检测信号小（A-4-1)。相对报告子活性低（A-5-1)。另一方面，设基因组上的特定的序 列不含多个甲基（A-2-2)。此时，当自我复制时，在所述构建体中官能团被取代，引起脱甲基 化（A-3-2)。此时，检测信号大（A-4-2)。相对报告子活性高（A-5-2)。
[0072] 或者，例如，准备含少的甲基的报告子核酸构建体（B-1)。设基因组上的特定的序 列含多个甲基（B-2-1)。此时，当自我复制时，所述构建体中的官能团被取代，发生甲基化 (B-3-2)。此时，检测信号小（B-4-2)。而且，在此时，随时间经过而信号变小。相对报告子 活性低（B-5-2)。另一方面，设基因组上的特定的序列不含多个甲基（B-2-2)。此时，当自 我复制时，在所述构建体中无官能团的取代，或者少（B-3-2)。此时，检测信号大（B-4-2)。 相对报告子活性高（B-5-2)。
[0073] 以上、显示报告子核酸构建体的报告子活性和甲基化的相关，但此相关仅用于例 示，对其无限定。
[0074]【1.报告子核酸构建体】
[0075] 报告子核酸构建体，例如，可为自我复制载体。接下来使用【附图说明】作为报告子核 酸构建体的自我复制载体。再有，对于相同的构成赋予相同的符号，对于说明则省略。另外， 可各实施方式的构成组合而在1个实施方式中利用，另外也可多个实施方式在1个分析中 同时使用。
[0076] 【第1实施方式】
[0077] 在得到细胞的表观遗传的信息的方法中，在细胞内复制起始蛋白质表达的条件 下，使用自我复制载体。自我复制载体也被称为"报告子载体"。
[0078] 使用图1，对于自我复制载体的1例进行说明。自我复制载体1含报告子基因表 达单位2和复制起始序列3。复制起始序列3与报告子基因表达单位2存在于相同的核酸 上。
[0079] 报告子基因表达单位2含目标核酸序列4、编码报告子蛋白质的报告子基因5和转 录终止信号序列6。
[0080] 目标核酸序列4是要得到表观遗传的信息的核酸序列。目标核酸序列4与被检细 胞有的特定的核酸序列，对于其序列具有相同性。再者，目标核酸序列4有被修饰碱基。然 后，自我复制载体1 (例如目标核酸序列4)有依赖于此被修饰碱基中的修饰的程度的启动 子活性。自我复制载体1(例如目标核酸序列4)的启动子活性的活化由目标核酸序列4上 的被修饰碱基的修饰控制。这样的被修饰碱基成为修饰的目标。目标核酸序列4根据希望 预先选择即可。从关于目标核酸序列4得到的表观遗传的信息，得到被检细胞中的特定的 核酸序列的表观遗传的信息。
[0081] 关于目标核酸序列4, "具有相同性的序列"是与基因组上的特定的序列相同的序 列，或者与基因组上的特定的序列实质上相同的序列即可。基因组上的特定的序列和实质 上相同的序列是指，例如，在所述特定的序列中，1个或数个碱基被取代、缺失或付加的序 列。另外，"特定的序列"是要得到表观遗传的信息的序列即可。例如，"具有相同性的"、"相 同的"及"相同的"是指对于基因组序列是90%以上或95%以上相同的序列即可。"基因组 上的序列和相同的序列"可为与在基因组上连续的特定的序列相同的序列，也可为与在基 因组上不连续的2个以上的特定的序列各自相同的序列一体化而成的序列。
[0082] 例如，目标核酸序列4可为将与在基因组上的多个位置存在的2个以上的序列各 自相同的序列一体化而成的序列，也可含那样的一体化而成的序列。换言之，将在基因组上 的多个位置上存在的2个以上的序列的各自作为1单位，则目标核酸序列4,对于这些多个 单位的各自，可含将各自相同的序列一体化的序列，也可含那样的一体化的序列。再换言 之，目标核酸序列4对应于作为在基因组上各自相同的序列的单位，也可由2个以上的单位 构成。在目标核酸序列4中，例如，也可为1个单位与基因组上的特定的启动子序列的部分 相同，另1个单位与含可控制所述启动子序列的活化的被修饰碱基的序列相同。
[0083] 例如，含基因组上的特定的启动子序列的部分和可控制此启动子序列的活化的被 修饰碱基的序列不是在基因组上必然连续存在。即，它们之间也可含进一步的序列。这样 的进一步的序列只要是对启动子序列及其活性无影响的序列，就没必要非得使目标核酸序 列4含那样的进一步的序列。另外，只要有依赖于目标核酸序列4上的被修饰碱基和被修 饰碱基中的修饰的程度的启动子活性，则目标核酸序列4除与被检细胞的基因组上的序列 有相同性的序列之外，也可含任意的进一步的序列。任意的进一步的序列不妨碍有依赖于 目标核酸序列4上的被修饰碱基和被修饰碱基中的修饰的程度的启动子活性。例如，任意 的进一步的序列可在构成与被检细胞的基因组上的序列有相同性的序列的任何的碱基之 间含有，也可邻接与被检细胞的基因组上的序列有相同性的序列而含有。
[0084] 在上述中，关于目标核酸序列4,记载了对于基因组上的序列"具有相同性的序 列"，但关于被检细胞，也同样地理解对于目标核酸序列4 "具有相同性的序列"即可。
[0085] 自我复制载体1是向被检细胞导入后复制自己的载体。目标核酸序列4是与被检 细胞的基因组中所含的特定的核酸序列具有相同性的序列。由这样的构成，利用自我复制 载体1的自我复制能力，将被检细胞的基因组上的相同的序列的修饰状态抄录到自我复制 载体1中的目标核酸序列4变得可能。
[0086] 目标核酸序列4的例，例如，可举出S0X2基因启动子序列、GFAP基因启动子序列、 CK19基因启动子序列及C0X2基因启动子序列等，对其无限定。
[0087] 目标核酸序列4的修饰，例如，是甲基化、烷基化。此时，目标核酸序列4的修饰的 状态是指对于构成目标核酸序列4的碱基结合或者未结合作为官能团的甲基及/或烷基。 被检细胞的"表观遗传的信息"是指可存在或不存在那样的官能团。或者其也可为何程度 的量的官能团存在的信息。或者其也可为那样的修饰的状态的变化、即官能团的取代的有 无或程度等的信息。另外，也可为它们之中之任何的组合。目标核酸序列4的修饰，例如， 也可为对目标核酸序列4的主链中的胞嘧啶及/或鸟嘌呤的修饰。在目标核酸序列4中存 在多个胞嘧啶及/或鸟嘌呤时，也可为关于它们之中之一或1个以上的修饰。例如，目标核 酸序列4的修饰可为对目标核酸序列4中的胞嘧啶及/或鸟嘌呤的甲基化。
[0088]启动子活性是指诱导与启动子序列的下游功能性地连接的基因的转录。目标核酸 序列4有启动子活性时，其启动子活性可为由目标核酸序列4的序列全体来源，也可为目标 核酸序列4之一部分的序列来源的。另外例如，目标核酸序列4也可含最小启动子。另外， 在可显示目标核酸序列4的启动子活性的序列的全体上连续或断续地存在被修饰碱基，在 可显示启动子活性的序列以外的目标核酸序列4的序列上存在被修饰碱基，也可为其组 合。目标核酸序列4的启动子活化由目标核酸序列4上的被修饰碱基的修饰的状态控制。 换言之，目标核酸序列4的启动子活性依赖于目标核酸序列4的序列内的碱基的修饰的程 度而活化。
[0089]目标核酸序列4的启动子活性，例如，在目标核酸序列4的被修饰碱基中的修饰 的程度低时活化，或者在修饰存在时活化，或者在修饰不存在之时活化等，也可为这些之任 何。对这样的启动子活性的目标核酸序列4的性质是称为"依赖于目标核酸序列4的序列 内的碱基的修饰的程度而活化"或"依赖于碱基中的官能团的取代的程度而活化"的性质的 例。
[0090] 有依赖于目标核酸序列4的序列内的被修饰碱基中的修饰的程度的启动子活 性的序列的例，例如，是被验细胞来源的序列即可，也可为人工地合成的序列。例如，那 样的序列的例也可为神经胶质细胞纤维性酸性蛋白质（GFAP;Glialfibrillaryacidic protein)基因的5'上游区域（-1651~+32bp)(SEQIDNO: 1)等。GFAP基因的5'上游区 域序列在目标核酸序列的甲基化不存在时活化。将其序列示于表2。或者，也可为细胞角蛋 白19(CK19)基因的5'上游区域（-617~+61bp)(SEQIDN0:2)或环加氧酶2(C0X2)基因 的5'上游区域（-540~+115bp)(SEQIDNO:3)等。这些的序列示于表2、表3及表4。
[0091]【表 2】〈SEQIDN0:1〉小鼠GFAP5' 上游区域（_1651bp~+32bp)序列
[0092]
[0093]【表3】〈SEQIDN0:2〉人CK19基因的5'上游区域（_617bp~+61bp)序列
[0097] 报告子基因5功能性地连接在目标核酸序列4的下游。即，目标核酸序列4功能 性地连接在报告子基因5的上游。报告子基因5通过目标核酸序列4活化而转录。由此转 录，报告子蛋白质表达。