[0020] 本发明还提供了所述表达载体或所述重组细胞在制备具有抗旱、耐盐及抗寒性能 玉米经济作物中的应用。
[0021] 本发明从玉米中分离出一段编码某一 FK506结合蛋白的全长cDNA，并在此基础上 克隆得到编码基因 ZmFKBP16-2,将其连接于表达载体上，并利用农杆菌侵染法转化拟南芥， 数据显示该基因能够显著提高转基因拟南芥在种子萌发期和幼苗发育早期及壮苗期的抗 旱性。同时通过过量表达该基因，获得了比野生型植株产量更高的转基因作物，本发明所述 的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源，有助于从根本上改善玉米作物的 抗旱性能。
【附图说明】
[0022] 为了使本发明的内容更容易被清楚的理解，下面根据本发明的具体实施例并结合 附图，对本发明作进一步详细的说明，其中
[0023] 图1是转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在含有100mM甘露醇的MS培养基 上的萌发情况；其中，WT代表野生型拟南芥种子，T代表转基因拟南芥种子；
[0024] 图2是转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在不同浓度甘露醇处理下种子萌 发率统计情况；其中，横坐标表示甘露醇浓度梯度，纵坐标表示种子萌发率;WT代表野生型 拟南芥种子，T代表转基因拟南芥种子；
[0025] 图3是转基因拟南芥幼苗与野生型拟南芥幼苗在含有不同浓度甘露醇的MS培养 基上的生长情况；其中，WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南芥；
[0026] 图4是转基因拟南芥与野生型拟南芥在干旱处理下平均根生长量；其中，横坐标 表示甘露醇浓度梯度，纵坐标表示平均根生长量;WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南 芥；
[0027] 图5是转基因拟南芥壮苗与对照在干旱处理下的生长情况；其中，左列表示正常 生长条件，右列表示失水12天的生长条件；WT代表野生型拟南芥，T代表转基因拟南芥；
[0028] 图6是转基因拟南芥种子与野生型拟南芥种子在不同浓度NaCl处理下种子萌发 率统计情况；其中，横坐标表示NaCl浓度梯度，纵坐标表示种子萌发率;WT代表野生型拟南 芥种子，T代表转基因拟南芥种子；
[0029] 图7是转基因拟南芥与野生型拟南芥植株在低温处理下存活率统计情况；其中， 横坐标表示温度梯度，纵坐标表示植株存活率；WT代表野生型拟南芥，Τ代表转基因拟南 芥。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于 此。
[0031] 生物材料来源：
[0032] 玉米昌7-2购自中国农业大学国际玉米改良中心；
[0033] 大肠杆菌（Ε. coli)DH5 α 和 ΒΜ25. 8、质粒 pTriplEx2、Pmdl8_T 均购自 Promega 公 司；
[0034] 载体 PBmi 购自 Clontech 公司。
[0035] 试剂来源：
[0036] DNA凝胶回收试剂盒、DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、ExTaq酶、DNA Blunting Kit、DNAMarkerDL2000+15000购自宝生物大连有限公司（Takara产品）；
[0037] TRIzol 试剂（No. 15596-026)购自 Life Technologies 公司。
[0038] 设备说明：
[0039] PCR 反应使用 2720Thermal Cycler 基因扩增仪，购自 Applied Biosystems 公司；
[0040] 琼脂糖凝胶电泳使用UVP Gel Documentation凝胶分析系统，购自Gene公司；
[0041] 琼脂糖凝胶电泳使用DYY-8C型电泳仪，购自北京六一仪器公司。
[0042] 实施例1 :玉米FK506结合蛋白编码基因 ZmFKBP16-2的获得
[0043] 1、玉米幼苗的处理：取玉米昌7-2生长10天的幼苗，以400mM甘露醇处理18小 时，收集叶片；
[0044] 2、总 RNA 的提取：采用 RNAeasy plant mini kit (promoga 公司产品）提取总 RNA ;
[0045] 3、使用 SMART cDNA Library Construction Kit (购自 Clontech 公司）构建玉米 干旱胁迫cDNA文库以及对照cDNA文库；
[0046] 4、使用反相Northern差异筛选法筛选，获得有表达差异的cDNA片断pTriplEx2 ; 具体步骤参照《植物基因工程原理与技术》中（王关林，方宏笃著，科学出版社，1998);
[0047] 5、将携带有表达差异的cDNA片断的pTriplEx2载体转入大肠杆菌BM25. 8 ;具体 步骤参照《植物基因工程原理与技术》中（王关林，方宏笃著，科学出版社，1998);
[0048] 6、序列测定：由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序，获得一条1086bp 的cDNA片断，即为玉米FK506结合蛋白编码基因 ZmFKBP16-2,核苷酸序列如SEQ ID NO. 1 所示，其中开放阅读框部分为681bp，由此推得为具有226个氨基酸的一段序列。
[0049] 7、同源检索：利用BLAST软件将分离出的序列与Genbank中的序列进行比较，确定 它属于玉米FK506结合蛋白基因。
[0050] 实施例2 :重组表达载体的构建
[0051] 取2 μ 1上述实施例1获得的玉米FK506结合蛋白编码基因 ZmFKBP16-2与pMD18-T 载体进行连接，操作步骤按Promega公司产品pMD18-T Vector system说明书进行。然后 转化大肠杆菌DH5 α菌株，转接于表面涂5-溴-4-氯-3-吲哚-β -D-半乳糖苷和X-gal 的含氨苄青霉素（1〇〇 μ g/ml)的LB平板上培养过夜。挑取白色菌落，在LB液体培养基中 培养过夜并进行菌落PCR鉴定；同时碱法提取质粒DNA进行序列测定，制得重组pMDIS-T载 体。
[0052] 用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶Sail酶切重组pMD18-T载体，然后与经限 制性内切酶BamHI和限制性内切酶Sail酶切的载体PBI121连接。连接产物转化DH5 α细 胞，然后在含卡那霉素（50 μ g/ml)的LB固体平板上培养，对菌落进行PCR鉴定和质粒DNA 的酶切分析；制得重组表达载体PBI121-ZmFKBP16-2。
[0053] 实施例3 :转基因拟南芥的获得
[0054] 将重组表达载体PBI121-ZmFKBP16-2转化农杆菌GV3101的感受态细胞，挑取转 入重组表达载体PBI121-ZmFKBP16-2的农杆菌的单克隆接种于含50mg/L卡那霉素的LB 液体培养基中，28°C振荡培养两天。将发酵液3000rpm/min离心5分钟，所得农杆菌沉淀 用含5wt%蔗糖和0. 03wt% SilwetL-77的侵染液悬浮（具体过程也可参见：程振东，卫志 明，许智宏，根癌农杆菌对甘蓝型油菜的转化及转基因植株的再生，植物学报，1994, 36 (9): 657-663)〇
[0055] 采用沾花浸染法转化哥伦比亚生态型野生型拟南芥（Col-Ο)(购自美国拟南芥生 物资源中心，ABRC，
[0056] http ：//www.biosci.ohio-state. edu/pcmb/Facilities/abrc/abrchome. htm)， 收获该当代转基因拟南芥植株所结的种子0\代），在含有50mg/LKan (卡那霉素）的MS培 养基筛选萌发的种子。将萌发的?\代幼苗移到培养土中，收获种子〇12代），然后经相同的 筛选过程得到纯合的Τ3代转PBI121-ZmFKBP16-2的转基因拟南芥种子。最后将Τ 3代转基 因拟南芥种子直接播种到培养土中，长出的1代转基因拟南芥植株在长日照条件下生长两 周左右开花。
[0057] 对1~3代转基因拟南芥进行转基因植株鉴定，包括：抗性培养基初步筛选、PCR扩增 进一步筛选阳性植株、West-blotting鉴定阳性植株；最终从通过West-blotting鉴定得 到阳性植株中选出条带清晰的株系，收获其种子，制得转基因拟南芥种子，进行抗逆表型鉴 定。
[0058] PCR扩增进一步筛选阳性植株的PCR引物如下：
[0059] 引物 1 :5 '-GTCCCTGTCGTCTCTGATGG-3' ；
[0060] 引物 2 :5 ' -GCTCTGCCGCTGGTCTTC-3 '。
[0061] 实施例4 :转基因拟南芥抗旱表型鉴定
[0062] 本实验设置以下两个对照：
[0063] 野生型对照：未转入任何质粒的野生型拟南芥（Col-Ο);
[0064] 空载体对照：按照获得T3代转入重组表达载体PBI 121-ZmFKBP16-2的转基因拟南 芥的方法，将空载体PBI121转入野生型拟南芥中，然后进行继代培养得到T3代转PBI121的 转基因拟南芥，制得空载体对照种子。
[0065] 1、甘露醇（