Mannitol)模拟干旱胁迫条件下的种子萌发实验
[0066] 取野生型拟南芥种子、空载体对照种子和转基因拟南芥种子，在MS培养基上进行 种子萌发实验，其中培养基中含不同浓度甘露醇（分别为1〇〇1111、20〇1111、30〇1111和40〇1111)，实 验条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照条件下的温度 为22-24°C，相对湿度为70-90 % ;黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大于90 %。
[0067] 在第7天统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图1和图2所示（WT表示 野生型拟南芥种子，T表示转基因拟南芥种子；空载体对照种子和野生型拟南芥种子的表 型一致，故图中未显示空载体对照），转基因拟南芥种子在培养基中甘露醇浓度为100mM、 200mM、300mM和400mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥种子和空载体对照种子的萌发 率。
[0068] 2、转基因拟南芥幼苗期干旱表型鉴定
[0069] 将在MS平板上正常发芽的子叶刚展平的生长一致的幼苗在无菌条件下移至含有 100mM、200mM和300mM甘露醇的MS平板上，置培养间，竖直放置平板，实验条件是光周期为 16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照条件下的温度为22-24°C，相对湿 度为70-90% ;黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大于90%。培养1周后拍照并测量 根长，实验重复3次。测定结果如图3和图4所示（WT表示野生型拟南芥，T表示转基因拟 南芥；空载体对照和野生型对照的表型一致，故图中未显示空载体对照），转基因拟南芥的 幼苗在培养基中甘露醇浓度为100mM、200mM、300mM时的生长情况显著好于野生型拟南芥 和空载体对照。
[0070] 3、转基因拟南芥成苗期干旱表型鉴定
[0071] 将在基质中正常生长且生长一致的转基因拟南芥株系与野生型拟南芥成苗共同 进行失水干旱处理。如图5所示（WT表示野生型拟南芥，T表示转基因拟南芥；空载体对照 和野生型拟南芥的表型一致，故图中未显示空载体对照），在正常的生长条件下，野生型与 超表达株系生长没有差异。经过12天的自然失水处理，野生型拟南芥和转基因拟南芥的成 苗都表现出了干旱抗性减弱的表型：野生型拟南芥株系普遍萎蔫较快，成活率低。相比之 下，转基因拟南芥萎蔫较慢，成活率高。与野生型相比，转基因拟南芥株系的抗旱能力明显 提尚。
[0072] 实施例中所采用的PCR、酶切、连接、转化等基因工程基本操作方法如无特殊说明 均可按记载于《分子克隆实验指南第三版》中（（美）J.萨姆布鲁克等著，科学出版社，2002 年出版），和《植物基因工程原理与技术》中（王关林，方宏笃著，科学出版社，1998)记载的 方法操作。
[0073] 实施例5 :转基因拟南芥抗盐表型鉴定
[0074] 本实验设置以下两个对照：
[0075] 野生型对照：未转入任何质粒的野生型拟南芥（Col-Ο);
[0076] 空载体对照：按照获得T3代转入重组表达载体PBI 121-ZmFKBP16-2的转基因拟南 芥的方法，将空载体PBI121转入野生型拟南芥中，然后进行继代培养得到T3代转PBI121的 转基因拟南芥，制得空载体对照种子。
[0077] NaCl胁迫条件下的种子萌发实验
[0078] 取野生型拟南芥种子、空载体对照种子和转基因拟南芥种子，在MS培养基上进行 种子萌发实验，其中培养基中含不同浓度NaCl (分别为75mM、lOOmM、150mM和200mM)，实验 条件是光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照条件下的温度为 22-24°(：，相对湿度为70-90%;黑暗条件下的温度为18-20°(：，相对湿度大于90%。
[0079] 在第7天统计种子萌发率，实验重复3次，测定结果如图6所示（WT表示野生型拟 南芥种子，T表示转基因拟南芥种子；空载体对照种子和野生型拟南芥种子的表型一致，故 图中未显示空载体对照），转基因拟南芥种子在培养基中甘露醇浓度为75mM、100mM、150mM 和200mM时的萌发率显著高于野生型拟南芥种子和空载体对照种子的萌发率。可见，本发 明所述转基因拟南芥种子在NaCl耐受性方面相对于野生型拟南芥具有更为优质的性能。
[0080] 实施例6 :转基因拟南芥抗寒表型鉴定
[0081] 将在基质中正常生长且生长一致的转基因拟南芥株系与野生型拟南芥成苗共同 进行低温胁迫处理（分别为_2°C、-4°C、-6°C、-8°C、-10°C )黑暗中6小时，黑暗培养过夜 后转入正常生长条件（光周期为16小时光照，8小时黑暗；光强为300-400umol/M2/S ;光照 条件下的温度为22-24Γ，相对湿度为70-90% ;黑暗条件下的温度为18-20°C，相对湿度大 于 90% )。
[0082] 实验结果如图7所示（WT表示野生型拟南芥，T表示转基因拟南芥；空载体对照和 野生型拟南芥的表型一致，故图中未显示空载体对照），在正常的生长条件下，野生型与超 表达株系生长没有差异。在经过不同的低温处理并在正常的生长条件下恢复一周后，转基 因拟南芥表现出更强的冻害抗性。与野生型相比，转基因拟南芥株系的抗寒能力明显提高。
[0083] 综上，本发明所述方案可有效改善作物的抗旱、耐盐及抗寒的性能，对于提升作物 的有效产量具有较大的改善。而实际种植实验数据也显示，采用本发明所述方案的转基因 种子，其作物的有效产量相对于在同等条件下种植的野生种子的有效产量提升约50%以 上；即便相对于在同等条件下采用现有技术中中国专利CN103243109A公开的方案处理后 的有效产量依然提升约30% (该方案中，转ZmFKBP20-l基因拟南芥在干旱条件下种子产量 与野生型对照相比，提高了 15%左右，而转ZmFKBP16-2基因拟南芥在干旱条件下种子产量 与野生型对照相比，提高了 50%以上，抗旱能力明显高于转ZmFKBP20-l拟南芥）。更重要的 是，在低温和盐胁迫处理下，转ZmFKBP20-l基因拟南芥与野生型对照相比，产量没有提高， 而转ZmFKBP16-2基因拟南芥种子产量则提高20 % -50 %，其耐盐和抗寒性能得到明显的改 善。
[0084] 显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对 于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或 变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或 变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
【主权项】
1. 一种玉米FK506结合蛋白，其特征在于，包含如SEQIDNO. 2所示的氨基酸序列。2. -种玉米FK506结合蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。3. -种编码权利要求1或2所述玉米FK506结合蛋白的基因ZmFKBP16-2,其特征在于， 包含如SEQIDNO. 1所示的核苷酸序列。4. 一种编码权利要求1或2所述玉米FK506结合蛋白的基因ZmFKBP16-2,其特征在于， 其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示。5. -种含有权利要求3或4所述的玉米FK506结合蛋白基因ZmFKBP16-2的表达载体。6. 根据权利要求5所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为重组质粒 PBI121-ZmFKBP16-2〇7. -种重组细胞，其特征在于，插入了权利要求3或4所述的玉米FK506结合蛋白基因 ZmFKBP16-2,或者含有权利要求5或6所述的表达载体。8. -种构建权利要求7所述重组细胞的方法，其特征在于：将权利要求3或4所述的 玉米FK506结合蛋白基因ZmFKBP16-2插入宿主细胞，使所述基因在所述宿主中有效表达； 或者将权利要求5或6所述的表达载体导入宿主细胞，以使所述表达载体在所述宿主中有 效表达。9. 权利要求3或4所述编码基因ZmFKBP16-2在制备具有抗旱、耐盐及抗寒性能玉米经 济作物中的应用。10. 权利要求5或6所述表达载体或权利要求7所述重组细胞在制备具有抗旱、耐盐及 抗寒性能玉米经济作物中的应用。
【专利摘要】本发明属于分子生物学和生物技术技术领域，具体涉及一种玉米FK506结合蛋白编码基因的克隆及表达，并进一步公开了其在改善经济作物抗旱性能中的应用。本发明从玉米中克隆了编码基因ZmFKBP16-2，并验证了该基因具有在种子萌发期、幼苗发育早期及成苗期调节植株抗旱功能的作用，经试验，通过过量表达该基因，可以获得比野生型植株产量更高的转基因作物。本发明的基因可为培育农作物新品种提供理论依据和基因来源。
【IPC分类】C07K14/415, C12N15/29, C12N15/82, A01H5/00
【公开号】CN105315355
【申请号】CN201510566205
【发明人】于彦丽, 孟昭东, 李艳姣, 李文才, 孙琦, 李娜娜, 李勐, 李文兰
【申请人】山东省农业科学院玉米研究所
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年9月8日