元素、土壤改良剂等复配生产生物复混肥，同时也可以作为生物农药。本发明 的混菌发酵方法为产品的实际生产应用打下了基础。
【附图说明】
[0021] 图1三株菌在基础培养基上的菌落形态。
[0022] 图2不同碳源对三株菌有效活菌数的影响。
[0023] 图3不同氮源对三株菌有效活菌数的影响。
[0024] 图4不同无机盐对三株菌有效活菌数的影响。
[0025] 图5不同微量元素对三株菌有效活菌数的影响。
[0026] 图6三株菌在混合培养时互不诘抗。
【具体实施方式】
[0027] 下面实例将进一步说明本发明方法的可行性和应用效果。
[0028] 实施例1混合培养基配方优化
[0029] 以牛肉膏3g/L、蛋白胨12g/L、葡萄糖20g/L、磷酸二氢钾2g/L、硫酸锌0. lg/L为 基础培养基，培养条件为起始pH值6. 5、28°C、180rpm振荡3d。通过镜检和培养基平板涂布 都能观察到三株菌，图1为基础培养基上三株菌的菌落形态，表明该基础培养基适合三株 菌的培养。
[0030] 分别以20g/L的添加量用蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉替代基础培养基中的葡萄糖， 考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图2所示，以可溶性淀粉为碳源时， 三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是蔗糖、麦芽糖、葡萄糖。可溶性淀粉与蔗糖、麦芽糖 对有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择蔗糖为碳源。
[0031] 分别以15g/L的添加量用麸皮、大豆粉、酵母粉替代基础培养基中的牛肉膏和蛋 白胨，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图3所示，以牛肉膏和蛋白胨 为氮源时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是大豆粉、酵母粉、麸皮。牛肉膏和蛋白胨 与大豆粉对有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择大豆粉为氮源。
[0032] 分别以lg/L的添加量用氯化钠、硫酸镁替代基础培养基中的磷酸二氢钾，考察它 们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图4所示，以磷酸二氢钾为无机盐时，三 株菌的总有效活菌数最高，其后依次是硫酸镁、氯化钠。因此选择磷酸二氢钾作为培养基中 的无机盐来源。
[0033] 分别以0. lg/L的添加量用硫酸铜、硫酸亚铁、氯化钙替代基础培养基中的硫酸 锌，考察它们对混合培养的三株菌的有效活菌数的影响，如图5所示，以硫酸锌为微量元素 时，三株菌的总有效活菌数最高，其后依次是氯化钙、硫酸铜、硫酸亚铁。硫酸锌和氯化钙对 有效活菌数的影响差异不显著，综合考虑成本，选择氯化钙作为培养基中的微量元素来源。
[0034] 分别选择最优的碳源、氮源、无机盐和微量元素按1^9 (3)4设计四因素三水平正交 试验，9个组合，重复3次。
[0035] 表1培养基优化正交试验因素及水平（单位：g/L)
[0037] 试验结果可知，大豆粉的极差最大，是影响三株菌有效活菌数的重要因子，其次依 次是磷酸二氢钾、蔗糖，最后是氯化钙，由有效活菌数考察各因子水平值，最佳培养基组合 为A2B3C3D3,即蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾lg/L、氯化钙0· lg/L。
[0038] 表2培养基优化正交试验设计与结果
[0039]
[0041] 实施例2菌株特定培养基和混合发酵培养基的培养效果比较
[0042] 东方伊萨酵母经过活化后用从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀 稀释至0D6。。为0. 2,以10%的接种量分别接种于以下三种已知可培养东方伊萨酵母的液体 培养基和本发明的混合发酵液体培养基中，28°C、180rpm培养48h，取样检测有效活菌数。
[0043] 表3三种已知东方伊萨酵母的培养基和本发明混合发酵培养基配方
[0044]
[0045] 地衣芽孢杆菌经过活化后从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三角瓶，摇匀稀 释至〇D6。。为0. 2,以10%的接种量接种于以下三种已知可培养地衣芽孢杆菌的液体培养基 和本发明的混合发酵液体培养基中，28°C、180rpm培养48h，取样检测有效活菌数。
[0046] 表4三种已知地衣芽孢杆菌的培养基和本发明混合发酵培养基配方
[0048] 淡紫拟青霉涂板平板5d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液，摇匀稀释 至0D6。。为0. 2,以10%的接种量将孢子悬液接种于以下三种已知可培养淡紫拟青霉的液体 培养基和本发明的混合发酵液体培养基中，28°C、180rpm培养72h取样检测有效活菌数。
[0049] 表5三种已知淡紫拟青霉的培养基和本发明混合发酵培养基配方
[0051] 在控制相同接种量的前提下，东方伊萨酵母在A、B、C、D四种不同培养基中培养 2处后，有效活菌数分别为2.6、0.6、4、1.9亿/1^，地衣芽孢杆菌在4、8、(：、0四种不同培养 中培养48h后，有效活菌数分别为0. 89、0. 02、0. 25、1. 2亿/mL，淡紫拟青霉在A、B、C、D四 种不同培养中培养72h后，有效活菌数分别为0. 2、0. 15、0. 25、8. 3亿/mL。结果显示，三种 微生物均可以在本发明的混合发酵培养基上良好生长，本发明培养基也适合只需生产一种 菌的需求。综合考虑培养基原料的价格和来源，本发明的混合发酵培养基配方为三菌的大 规模应用提供了必要的前提条件。
[0052] 实施例3混合发酵接种量的质控
[0053] 为了控制混合发酵体系各种菌的初始接种有效活菌数，使各种菌的初始有效活菌 数在已知可控范围，结合种子液有效活菌数与〇D6。。值之间的关系，制作了三株菌种子液有 效活菌数与〇D6。。值之间的标准曲线。
[0054] 淡紫拟青霉经接种后，培养4~6d收集孢子，用生理盐水洗涤孢子制备孢子悬液， 用无菌水调节孢子悬液至〇D6。。为0. 2,以10%的接种量将孢子悬液接种到液体培养基中， 28°C、180rpm培养2d，制得淡紫拟青霉种子液，经稀释涂板计数与0D6。。值的测量，得出淡紫 拟青霉种子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 0. 3386X-0. 0318, R 2 = 0.9803。
[0055] 东方伊萨酵母经过接种后，培养1~2d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三 角瓶，摇匀稀释，测得〇D6。。为0. 2,以10%的接种量接于10mL的液体培养基28°C、160rpm培 养2d，制备东方伊萨酵母种子液，经稀释涂板计数与0D_值的测量，得出东方伊萨酵母种 子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 0. 6703X-0. 0717, R2= 0. 9927。
[0056] 地衣芽孢杆菌经过接种后，培养2~3d从斜面刮取一环菌体于装有生理盐水的三 角瓶，摇匀稀释，测得〇D6。。为0. 2,以10 %的接种量接于10mL的液体培养基30°C、160rpm 培养2d，制备地衣芽孢杆菌种子液，经稀释涂板计数与0D_值的测量，得出地衣芽孢杆菌 种子液有效活菌数（亿/mL)与0D6。。值之间的关系为：y = 2. 1695X-0. 0659，R2= 0. 9976。
[0057] 三株菌种子液分别以10 %的接种量接种至混合发酵培养基中，根据种子液有效活 菌数与0D6。。值之间的关系，对种子液进行合理的稀释，控制地衣芽孢杆菌比其他两株菌的 有效活菌数高一个数量级，可显著提高混菌发酵终点的有效活菌数。混菌发酵时控制各菌 株有效活菌数的比例，有利于各菌之间互相协同，达到最优的发酵效果。
[0058] 实施例4三株菌在混合培养时互不拮抗
[0059] 分别在PDA、YPD、营养琼脂培养基上活化菌株淡紫拟青霉、东方伊萨酵母、地衣芽 孢杆菌，将活化好的三株菌转接到相应的液体培养基上制备种子液。
[0060] 通过划线点接法，将沾有东方伊萨酵母和地衣芽孢杆菌种子液的灭菌牙签交叉划 线于本发明的混合发酵培养基平板上，同时在中间区域点接100 μ L的淡紫拟青霉种子液， 如图6所示。培养基成分为：蔗糖15g/L、大豆粉10g/L、磷酸二氢钾lg/L、氯化钙0. lg/L， 琼脂2(^/1，起始？!1值6.5。
[0061] 28°C培养2~3d，观察三种菌株间的相互作用。
[0062] 如图6所示，土壤有益微生物淡紫拟青霉、地衣芽孢杆菌、东方伊萨