式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
[0019] 图1为表达sgRNA的重组质粒的结构示意图；
[0020] 图2为表达StCas9的重组质粒的结构示意图；
[0021] 图3为同时表达sgRNA和StCas9的重组质粒的结构示意图；
[0022] 图4为根据本发明的一种实施方式对HEK293T细胞的CXCR4基因进行敲除后的测 序结果。
【具体实施方式】
[0023] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0024] 在本发明中，在未做相反说明的情况下，使用的术语"基因敲除"或"基因编辑"是 指对生物的基因组DNA进行删除、插入或者替换，从而达到对目的序列修改的目的；本发 明涉及的sgRNA和CRISPR_Cas9系统均为人工改造而成的（engineering，non-naturally occurring)〇
[0025] 在第一方面中，本发明提供的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列如SEQ ID N0:l-248 中任意一个的第 η-30 位所示且 η = 1-12(整数，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。
[0026] 在第二方面中，本发明提供的sgRNA的序列为：5' -识别序列-招募Cas9蛋白的 序列-3'，其特征在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID N0:1-248中任意一个的第 η-30 位所示且 n = 1-12(整数，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11 或 12)。其中，表示多核苷 酸元件（识别序列和招募Cas9蛋白的序列）以有功能的方式连接，互不干涉表达或性能， 被连接的多核苷酸序列是连续的。
[0027] 所述招募Cas9蛋白的序列为能够招募Cas9蛋白的序列，即结合Cas9蛋白并使其 活化而能够切割目标基因的序列，通常具有特定的二级结构（如茎环结构）。优选地，所述 招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID N0:249-252所示。
[0028] 所述Cas9蛋白可以来源于嗜热链球菌（S. thermophilus)，如在UniProt中的 Entry Name为CAS9_STRTR的蛋白。Cas9蛋白的氨基酸序列也可参见NCBI的EWM58113. 1、 WP_011681470. 1、sp|G3ECRl. 2|CAS9_STRTR、WP_014727651. 1、WP_024703962. 1、 WP_014608595. UETE40675. UETE40173. 1 或 EWM55849. 1 等。例如，Cas9 蛋白的氨基酸序 列如SEQ ID NO:260所示。
[0029] 根据本发明的一种优选实施方式，所述识别序列对应的DNA序列如SEQ ID NO:49 所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID NO:249所示。该优选的sgRNA能够更有效地编辑 (敲除）CXCR4基因。
[0030] 在第三方面中，本发明提供了编码第二方面所述的sgRNA的DNA分子。
[0031] 在第四方面中，本发明提供的CRISPR_Cas9系统包括Cas9蛋白和sgRNA、和/或 包括携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列 和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，所述sgRNA为第二方面所述的sgRNA且所 述Cas9蛋白源自嗜热链球菌。
[0032] 所述载体为能够传递所携带的核酸（编码序列）的核酸分子。所述载体可以为质 粒、λ噬菌体、柯氏质粒、YAC载体等。在特定的实施方式中，所述载体为真核表达载体，如 pcDNA3〇
[0033] 携带有sgRNA的编码序列的载体的结构可以如图1所示。携带有Cas9蛋白的编 码序列的载体的结构可以如图2所示。同时携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码 序列的载体的结构可以如图3所示。
[0034] 如上所述，所述Cas9蛋白的编码序列来源于嗜热链球菌，且可以为经密码子优化 后适于在真核细胞中表达的序列（如SEQ ID N0:256第3815-8107位所示的序列）。
[0035] 根据本发明的优选实施方式，所述sgRNA为"识别序列对应的DNA序列如SEQ ID N0:49所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQ ID N0:249所示"的sgRNA。
[0036] 在第五方面中，本发明提供的编辑CXCR4基因的方法包括：将第四方面所述的 CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。编辑CXCR4基因能够实现CXCR4基因表达的 上调、下调、或者丧失，优选下调和丧失。所述细胞可以来源于灵长类动物，优选来源于人。 该方法可以在体内或体外实施。
[0037] 在第六方面中，本发明提供了第四方面所述的CRISPR_Cas9系统在制备用于预防 和/或治疗HIV感染的药物中的应用。
[0038] 需要说明的是，本发明提供的各个sgRNA可以联合使用，可以是任意两种或多种 sgRNA的联合使用，通过联合使用，CRISPR-Cas9系统可以靶向多个位点，从而能够更有效 地敲除CXCR4基因。
[0039] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。若未特别指明，实施例中所用的技术 手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0040] 在以下实施例中，涉及的寡核苷酸序列委托金斯瑞生物科技有限公司合成得到。
[0041] 实施例1
[0042] 本实施例用来说明本发明的sgRNA的设计。
[0043] 根据5'-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3'和下表1所示的碱基序列构建992 个 sgRNA〇
[0044] 表 1
[0048] 实施例2
[0049] 本实施例用来说明本发明的CRISPR_Cas9系统的构建。
[0050] (1)在sgRNA对应的DNA序列（如实施例1所示）的5'末端加上CACC得到正向 寡核苷酸（Forward oligo)，根据此sgRNA，获得其互补链，并且在其5'末端加上AAAC得到 反向寡核苷酸（Reverse oligo)。分别合成。如果sgRNA识别序列对应的DNA序列5'末端 第一个碱基不为G，则需要在CACC之后加入一个G，相应的在反向寡核苷酸的3'末端加入 一个匹配的C。将上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸成对变性、退火，退火后形成可以连入 U6真核表达载体中的双链sgRNA寡聚核苷酸，变性、退火的体系为：
ΙμΙ 1〇χΤ4 Ligation Bullcr (NEB) 6,5μ1 DNasc/RNasc~Frcc Water 0.5μΙ T4PNK (NEB M0201S)
[0053] PCR的条件为：37°C 30min ;95°C 5min ;然后以5°C /min的速率缓慢降温至25°C ; 置于4°C下保存待用。
[0054] (2)对质粒进行BsmBI酶切和去磷酸化，反应体系如下：
[0055] 5,ug 质粒（参见随附的重组质粒的序列设计） 3μ1 FaslDigcsl BsmBI (Fermentas) 3μΙ FastAP (Fcrmc;nlas ) 6μΙ lO^FaslDigt^sl Buffer 0.6μ1 lOOmMDTT (新鲜配制的) 添加 ddH^O 个.60μL
[0056] 37 °C孵育1小时，产物进行琼脂糖凝胶电泳，利用胶回收试剂盒（TIANGEN， DP080822)切胶回收酶切产物。
[0057] (3)退火后的双链sgRNA寡聚核苷酸具有BsmBI的粘性末端，将其与被BsmBI酶切 过的质粒进行连接反应，连接反应的体系为：
[0058] ΧμΙ 酶切后的质粒（50ng) ΙμΙ 按1:200稀释的退火后的双链sgRNA寡聚核苷酸 5μ! 2xQuick Llgasc Buflcr (NEB) /!JII \ DNaso/RNasc-Frcc Waicr 1·. 10μL 1μ! Quick Ligasc (NEB M2200S)
[0059] 16°C孵育1小时。
[0060] (4)将上述连接产物转化到Stbl3感受态细胞（购自博迈德生物技术有限公司） 中，涂Amp+(100 μ g/ml)，挑取单克隆。
[0061] (5)通过PCR鉴定获得阳性克隆，使用的引物如下：
[0062] FI：TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO:253)
[0063] R1：CCAATTCCCACTCCTTTCAAG(SEQ ID NO:254)<