br>[0064] 反应体系为：缓冲液，2. 5ul ;dNTP，2. 5ul ;ExTaq(TaKaRa)，0. 15ul ;稀释菌液， lul ;引物 F1/R1，0. 3ul ;ddH20，18. 25ul。
[0065] PCR 的条件为：37°C 30min ;94°C 5min ; (94°C 30s ;68°C 30s ;72°C 45s)22 个循 环；72°C 8min ;置于4°C下保存待用。
[0066] 测序验证质粒序列的正确性。
[0067] (6)37°C摇床过夜培养阳性克隆，并用质粒小提试剂盒（TIANGE，DP106-02)抽提 质粒，获得表达sgRNA的重组质粒U6-hCXCR4sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE (见图1，其中一种的序 列如SEQ ID N0:255所示，将SEQ ID N0:255的第2857-3008位替换不同的sgRNA编码序列 可以获得表达实施例1中各个sgRNA的重组质粒）、表达StCas9的重组质粒U6-EFla-NLS- stCas9-2A-Pur〇-WPRE(见图 2,其中一种的序列如 SEQ ID N0:256 所示，将 SEQ ID N0:256 的第3815-8107位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达不同Cas9的重组质粒）以及共 同表达 StCas9 和 sgRNA 的重组质粒 U6-hCXCR4sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPR E (见图3,其中一种的序列如SEQ ID NO: 257所示，将SEQ ID NO: 257的第2857-3008位替 换不同的sgRNA编码序列且第4207-8499位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达实施 例1中的各个sgRNA和不同Cas9的重组质粒）。
[0068] 实施例3
[0069] 本实施例用来说明使用本发明的CRISPR_Cas9系统编辑CXCR4基因的方法。
[0070](一）细胞培养和转染
[0071] (1)将HEK293T细胞（CBR-130005,购自上海赛齐生物工程有限公司）在DMEM高 糖培养基（含有10%的FBS、青霉素（penicillin，100U/ml)和链霉素（streptomycin， 100μg/ml))中进行培养；
[0072] (2)转染前分至六孔板中，细胞密度达70 %时进行转染；
[0073] (3)按照 Lipofectamine 3000 (Invitrogen，11668-019)用量比例，使 用 3 μ g 的 U6-hCXCR4sgRNA-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE、或者 1. 5 μ g 的 U6-hCXCR4sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE 和 1· 5 μ g 的 U6-EFla-NLS-StCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE 组 合转染每孔细胞，8h后换液，相应的，加入噪呤霉素（Puromycin)和G418(Geneticin)进行 药筛，48h后收取细胞。
[0074] (二）TA克隆测序检测：
[0075] ⑴将收集的细胞在裂解液（10 μΜ Tris-HCl，0. 4M NaCl，2 μΜ EDTA，1% SDS)中， 用100 μ g/ml蛋白酶Κ裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到100 μ 1去离子水中；
[0076] (2)使用引物F2/R2进行PCR扩增，使用试剂盒（TIANGEN，DP080822)纯化PCR回收 产物，其中，F2 :CCCTTAGCCCACTACTTCAG(SEQ ID N0:258)，R2 :ACATCTGTGTTAGCTGGAGTG(SEQ ID NO :259)；
[0077] (3)将获得的PCR回收产物用rTaq进行加 A反应，体系为：
[0078] 800ng PCR回收产物 5μΙ lOxBuficr ( IS'i Mg2-) 3 μ! Mg3- 4μ1 dNTP 0.5μ! rTaq (TAKARA) 加入ddH2〇到50μ1
[0079] 37°C温浴30min，取1 μ 1产物与pMD19-T载体（TAKARA，3271)连接（连接方式参 见PMD19-T载体的说明书）并转化ToplO感受态细胞（购自博迈德生物技术有限公司）。
[0080] (4)挑取单克隆进行测序，根据测序结果发现：靶基因 CXCR4在SgRNA靶向的序列 处出现了缺失和插入（indel)，导致CXCR4发生移码突变，基因敲除成功。其中，针对识别 序列对应的DNA序列为SEQ ID N0:49且招募Cas9蛋白的序列为SEQ ID N0:249的sgRNA 处理后的单克隆的测序结果如图4所示（其中，箭头表示Csa9切割位点，浅色部分为对HIV 天然免疫的人群中基因序列的缺失片段；随机挑选48个克隆，一共检测到9个克隆携带引 起移码或者提前终止的突变，突变率为9/48 = 18. 8% )。
[0081] 从以上实施例可以看出，本发明的CRISPR_Cas9系统能够实现人CXCR4基因的敲 除，且敲除效率也较高。
[0082] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0083]另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0084] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQIDN0:l-248 中任意一个的第n-30位所示且η= 1-12。2. -种sgRNA，该sgRNA的序列为：5' -识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3'，其特征 在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO: 1-248中任意一个的第n-30位所示且η =1-12〇3. 根据权利要求2所述的sgRNA，其中，招募Cas9蛋白的序列如SEQIDΝ0:249-252 所示。4. 根据权利要求2或3所述的sgRNA，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQID NO:49所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:249所示。5. 编码权利要求2、3或4所述的sgRNA的DNA分子。6. -种CRISPR-Cas9系统，其特征在于，该CRISPR-Cas9系统包括： Cas9蛋白和sgRNA，和/或 携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序列 和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上， 其中，所述sgRNA为权利要求2、3或4所述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus)〇7. 根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9系统，其中，所述sgRNA为权利要求4所述的 sgRNA〇8. -种编辑CXCR4基因的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的 CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞来源于灵长类动物，优选来源于人。10. 权利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的 药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种源自嗜热链球菌的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，如SEQ？ID？NO:1-248中任意一个的第n-30位所示且n＝1-12。本发明还公开了序列为5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其编码DNA分子，识别序列对应的DNA序列与靶序列相同。本发明还公开了一种CRISPR-Cas9系统，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体。本发明还公开了CRISPR-Cas9系统在编辑CXCR4基因和制备用于HIV感染的药物中的应用。本发明可以实现CXCR4基因的编辑，使得细胞无法被HIV感染。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/11, C12N5/10, A61P31/18, C12N15/85, A61K48/00
【公开号】CN105316337
【申请号】CN201510693074
【发明人】张竞方, 秦小平
【申请人】芜湖医诺生物技术有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月20日