9， 1728-1732;美国专利号6, 432, 360、美国专利号6, 485, 944、美国专利号6, 511，803 ;通过 引用以其整体结合到本文中）、454皮滴定焦磷酸测序技术（Margulies等，2005Nature 437，376-380;US20050130173;通过引用以其整体结合到本文中）、Solexa单碱基添加 技术（Bennett等，2005，PharmacoGenomics, 6，373-382;美国专利号 6, 787, 308;美 国专利号6, 833, 246;通过引用以其整体结合到本文中）、Lynx大规模平行特征测序技术 (Brenner等（2000).Nat.Biotechnol. 18:630-634;美国专利号 5,695,934;美国专 利号5, 714, 330;通过引用以其整体结合到本文中）和AdessiPCR集落技术（Adessi等 (2000).NucleicAcidRes. 28，E87;TO00018957;通过引用以其整体结合到本文中）。
[0077] 下一代测序（NGS)方法享有大规模平行高通量策略的共同特征，目的为与较旧测 序方法相比较低的成本（参见例如，Voelkerding等，CAeva,妨·· 641-658， 2009;MacLean等，TfeK.ificiOAioJ·，7.· 287-296;各自通过引用以其整体结 合到本文中）。NGS方法可广泛地分为通常使用模板扩增的方法和不使用模板扩增的方法。 需要扩增的方法包括由Roche作为454技术平台（例如GS20和GSFLX)商业化的焦磷 酸测序、LifeTechnologies/IonTorrent、由Illumina商业化的Solexa平台、GnuBio和 由AppliedBiosystem商业化的SupportedOligonucleotideLigationandDetection (SOLiD)平台。亦称为单分子测序的非扩增方法的实例为由HelicosBioSciences商业化 的HeliScope平台和分别由VisiGen、OxfordNanoporeTechnologiesLtd.和Pacific Biosciences商业化的显现中的平台。
[0078] 在焦磷酸测序（Voelkerding等，CAeva，641-658，2009; 1&^1^&11等，他加1^你^.#_/^1'〇以〇2，7.，287-296;美国专利号6,210,891;美国专利 号6, 258, 568;各自通过引用以其整体结合到本文中）中，将模板DNA片段化，末端修复，与 衔接头连接，和通过用带有与衔接头互补的寡核苷酸的珠捕获单模板分子进行原位克隆扩 增。带有单模板类型的各个珠经区室化至油包水微泡中，和使用称为乳液PCR的技术进行 模板克隆扩增。扩增后破坏乳液，和将珠沉积到在测序反应期间起流动池作用的皮滴定板 的各个孔中。在测序酶和发光报道物例如萤光素酶的存在下在流动池中有序反复地引入四 种dNTP试剂中的每一个。在将合适的dNTP加入测序引物的:V端的事件中，ATP的得到产 物引起孔内突发发光，其使用CCD照相机记录。获得大于或等于400个碱基的阅读长度是 可能的，和可获得1〇6个序列读出，产生多达5亿个碱基对（Mb)的序列。
[0079] 在Solexa/Illumina平台（Voelkerding等，，5^·· 641-658， 2009;]\&1(31^&11等，他加1^你^.#_/^1'〇以〇2，7,287-296;美国专利号 6,833,246;美 国专利号7，115, 400;美国专利号6,969, 488;各自通过引用以其整体结合到本文中）中， 测序数据以较短长度读出的形式产生。在该方法中，单链片段化DNA经末端修复以产生 5'-磷酸化的平末端，接着Klenow介导加入单个A碱基至片段的3'末端。A-加入促进 加入T突出端衔接头寡核苷酸，其随后用于在流动池的表面上捕获模板-衔接头分子，所述 表面散布有寡核苷酸锚。所述锚用作PCR引物，但因为模板的长度和其与其它邻近锚寡核 苷酸接近，通过PCR的延伸导致分子"拱起（archingover)"以与邻近的锚寡核苷酸杂交， 以在流动池的表面上形成桥结构。将这些DNA环变性和切割。然后正向链用可逆的染料终 止子测序。掺入的核苷酸的序列通过检测掺入后荧光来测定，除去每个荧光团和嵌段后进 行下一个dNTP加入循环。序列读出长度范围为36个核苷酸至超过250个核苷酸，每次分 析运行总共输出超过十亿个核苷酸对。
[0080] 使用 SOLiD 技术（Voelkerding等，β?··，妨·· 641-658，2009; 1&^1^&11等，他加1^你^.#_/^1'〇以〇2，7.，287-296;美国专利号5,912，148;美国专利 号6, 130, 073;各自通过引用以其整体结合到本文中）测序核酸分子还包括将模板片段 化，与寡核苷酸衔接头连接，与珠连接，和通过乳液PCR克隆扩增。在这之后，将带有模板的 珠固定在玻璃流动池的衍生表面上，将与衔接头寡核苷酸互补的引物退火。然而，并非利用 该引物进行3'延伸，而是其用于提供5'磷酸基团进行与包含两个探针-特异性碱基接着 6个简并碱基和4个荧光标记之一的询问探针连接。在SOLiD系统中，询问探针具有在每个 探针的3'端上的两个碱基的16种可能组合和在5'端上的四种荧光团之一。荧光团的颜 色和因此每个探针的身份对应于特定的颜色空间编码方案。多轮（通常7轮）探针退火、 连接和荧光团检测之后是变性，然后使用相对于起始引物偏离一个碱基的引物进行第二轮 测序。以该方式，模板序列可在计算上重建，和模板碱基询问两次，导致准确性增加。序列 读出长度平均为35个核苷酸，和每次测序运行总共输出超过40亿个碱基。
[0081] 在某些实施方案中，该技术在纳米孔测序（参见例如Astier等，J.Am.Chem. Soc. 2006年二月8日；128(5):1705 - 10,通过引用结合到本文中）中找到用途。纳米 孔测序的原理涉及当将纳米孔浸入电导液中和电位（电压）横过它施用时发生了什么。在 这些条件下，可观察到由于离子通过纳米孔的传导所致的轻微的电流，和电流的量对纳米 孔的大小非常敏感。当核酸的各碱基通过纳米孔时，这引起通过纳米孔的电流强度改变，其 对于四个碱基中的每个不同，从而允许测出DNA分子的序列。
[0082] 在某些实施方案中，该技术在HelicosBioSciences的HeliScope(Voelkerding 等，Clinical Chem.，55:色认-松说，2Q的lacLean等，Nature Rev. Microbiol.， 7.· 287-296;美国专利号7, 169, 560;美国专利号7, 282, 337;美国专利号7, 482, 120; 美国专利号7, 501，245;美国专利号6, 818, 395;美国专利号6, 911，345;美国专利号 7,501，245;各自通过引用以其整体结合到本文中）中找到用途。模板DNA片段化和在3' 端多腺苷酸化，最终的腺苷带有荧光标记。变性的多腺苷酸化模板片段与在流动池的表面 上的多聚（dT)寡核苷酸连接。捕获的模板分子的起始物理位置通过CCD照相机记录，然后 切割标记和洗掉。通过加入聚合酶和连续加入荧光-标记的dNTP试剂实现测序。掺入事 件产生对应于dNTP的荧光团信号，和在每轮dNTP加入前通过CCD照相机捕获信号。序列 读出长度范围为25 - 50个核苷酸，每次分析运行总共输出超过10亿个核苷酸对。
[0083] IonTorrent技术是基于氢离子检测的DNA测序方法，所述氢离子在DNA聚合期间 释放（参见例如327(5970) : 1190 (2010);美国专利申请公开号20090026082、 20090127589、20100301398、20100197507、20100188073 和 20100137143,通过引用以其整 体结合用于所有目的）。微孔含有待测序的模板DNA链。微孔层的下方是高度敏感的ISFET离子传感器。所有的层包含在类似于电子工业中使用的那些的CMOS半导体芯片内。当dNTP 掺入至成长的互补链中时，释放氢离子，其触发高度敏感的离子传感器。如果均聚物重复存 在于模板序列中，则多个dNTP分子将在单个循环中掺入。这产生对应数量的释放的氢和 按比例更高的电子信号。该技术不同于其它测序技术，因为没有使用修饰的核苷酸或光学。 IonTorrent测序仪的全碱基准确度对于50个碱基读出为约99. 6%，其中每次运行产生约 100Mb至100Gb。读出长度为100-300个碱基对。长度为5个重复的均聚物重复的准确度 为约98%。离子半导体测序的益处是快的测序速度和低的预付成本和操作成本。
[0084] 所述技术在由StratosGenomics,Inc.开发的另一种核酸测序方法中找到用途， 并且涉及使用Xpandomer。该测序方法通常包括提供由模板定向合成产生的子链。子链通 常包括在对应于所有或部分的靶核酸的连续核苷酸序列的序列中偶联的多个亚单位，其中 各个亚单位包括接头、至少一个探针或核碱基残基、和至少一个可选择性切割的键。可选择 性切割的键经切割得到长度大于子链的所述多个亚单位的Xpandomer。Xpandomer通常包 括接头和报告元件，其用于分析对应于所有或部分的靶核酸的连续核苷酸序列的序列中的 遗传信息。然后检测Xpandomer的报告元件。涉及基于Xpandomer的方法的其它细节描述 于例如提交于2008年6月19日的标题为"通过Expansion的高通量核酸测序"的美国专 利公开号20090035777,所述专利以其整体结合到本文中。
[0085] 其它显现中的单分子测序方法包括使用VisiGen平台通过合成进行的实时测序 以〇611?^(^1^等，^^^^(^〇￡观，5万..641 - 58，2009;美国专利号 7,329,492;美国 专利申请系列号11/671956;美国专利申请系列号11/781166;各自通过引用以其整体结 合到本文中），其中固定的已引发的DNA模板使用荧光修饰的聚合酶和荧光受体分子进行 链延伸，在核苷酸加入时产生可检测的荧光共振能量转移（FRET)。
[0086] 在一些实施方案中，检测方法利用杂交测定。核酸杂交技术的说明性的非限制性 实例包括但不限于微阵列，其包括但不限于：DNA微阵列（#/勿cDNA微阵列和寡核苷酸微 阵列）。DNA微阵列，通常称为基因芯片、DNA芯片或生物芯片，是连接在固体表面（例如玻 璃、塑料或硅芯片）上的细微的DNA斑点的集合，为表达概况分析或同时监测数千个基因的 表达水平的目的而形成阵列。附着的DNA区段称为探针，数千个探针可用于单个DNA微阵 列。微阵列可用于通过比较疾病和正常细胞中的基因表达来鉴定疾病基因或转录物。微阵 列可使用多种技术制作，包括但不限于：用细尖的针打印到玻璃载玻片上；使用预制的掩 膜的照相平板印刷术；使用动态微镜装置的照相平板印刷术；喷墨印刷；或在微电极阵列 上的电化学。
[0087] Southern和Northern印迹分别用于检测特定的DNA或RNA序列。将从样品中提 取的DNA或RNA片段化，在基质凝胶上电泳分离和