A3. 1-flag-EtCHP317转染4化后的DF-1 细胞进行免疫巧光检测。结果显示：PCDNA3. 1-flag-EtCHP317转染的DF-1细胞检测到 明显的绿色巧光，而PCDNA3. 1-flag转染的DF-1细胞未见绿色巧光，表明真核表达重组质 粒PCDNA3. 1-flag-EtCHP317成功转染DF-1细胞，且能在DF-1细胞中表达（见图10)。
[0106] 同时收集转染的DF-1细胞，加入Western及IP细胞裂解液提取蛋白，SDS-PAGE电 泳后转移至PVDF膜上，进行Western-Blot检测蛋白是否表达，一抗为兔抗化-EtCHP317蛋 白多抗血清，二抗为近红外巧光羊抗兔IgG。结果显示，在转染重组质粒pcDNA3. 1-flag-Et CHP317的DF-1细胞中，可W检测到大小为33kDa的蛋白质条带；而在转染空载体质粒的 DF-1细胞中，未检测到相应的目的条带（图11)。表明PCDNA3. 1-flag-EtCHP317重组质 粒在DF-1细胞中表达。
[0107] 结果表明化CHP317在真核表达系统中能成功表达，可用于筛选新型疫苗（包括 DNA疫苗、重组蛋白疫苗）和新型药物的祀标。
[010引 3.用Co-IP验证化CHP317和化AMA1的相互作用关系
[0109] 免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation，C〇-IF〇是利用抗原和抗体的特异性结合 W及细菌的ProteinA或G特异性地结合到免疫球蛋白的Fc片段的现象开发出来的方法。 其基本原理是，在细胞裂解液中加入感兴趣蛋白的抗体，解育后再加入与抗体特异结合于 Agarose珠上的ProteinA或G，若细胞中有与兴趣蛋白结合的目的蛋白，就可W形成运样 一种复合物："兴趣蛋白-抗性蛋白抗体-ProteinA或G-Agarose珠"，经变性聚丙締酷胺 凝胶电泳，复合物又被分开。然后经免疫印迹或质谱检测目的蛋白。该研究技术是研究蛋 白质相互作用的传统方法之一，可信度高，应用广泛。目前该研究技术已经在各生物研究领 域得到广泛应用，鉴定了许多关键的蛋白质间的相互作用，大大促进了对运些生物活动与 机制的认识和理解。本实验按照化ermo公司的Co-IP试剂盒操作说明进行，实验结果用 westernblot来检测。结果如图12所示。
[0110] 实施例9用双分子巧光互补技术验证化CHP317基因与化AMA1的相互作用关系
[0111] 1.重组真核质粒地iFC-VC155-EtCHP317的构建
[0112] 将鉴定正确的重组质粒pGEM-T-EtCHP317和真核表达载体地iFC-VC155分别用 EcoRI和BglII进行双酶切，电泳后将化CHP317目的条带和酶切的地iFC-VC155载体分 别进行胶回收，然后4°C连接过夜，将连接产物转化到大肠杆菌ToplO感受态细胞中，经PCR 鉴定为阳性的菌液提质粒进行双酶切鉴定（见图13)，结果显示：成功构建了真核表达重组 质粒地iFC-VC155-EtCHP317。
[0113] 2.真核重组表达质粒地iFC-VC155-EtCHP317转染DF-1细胞
[0114] 将处于对数生长期的DF-1细胞用膜酶消化后，按每孔60万细胞置于6孔细胞 培养板中传代培养，24h后开始转染，转染步骤按照Lipofectamine2000操作说明书进行， W地iFC-VC155-EtCHP317和地iFC-VN155-EtAMA1共转染DF-1细胞，并设立阳性对照 组地iFC-b化nVN55 (I152L)和地iFC-b化SVC155、阴性对照组地iFC-b化nVN55 (I152L)和 pBiFC-b化s(deltaZIP)VC155,操作同上。转染后3化左右，将细胞培养板取出，在倒置巧 光显微镜下观察细胞所发出的的巧光情况（图14)。BiFC技术不需要提取蛋白，可在活 细胞内可视化的观察蛋白质互作关系，该技术是将绿色巧光蛋白（GF巧分子从环状结构 的特定位点切割成N端片段和C端片段，然后将其和拟观察的目的蛋白融合表达，如果目 的蛋白间可W相互作用，它们会相互靠近，使巧光蛋白的活性恢复，发出绿色巧光。本实 验中将CHP317基因连接到pBiFC-VC155上与GFP的C端融合表达，将化AMAl基因连接 到地iFC-VN155上与GFP的N端融合表达，将其分别共转染进DF-1细胞后，3化后观察绿 色巧光，同时设立阳性对照组地iFC-b化nVN55(I152L)和地iFC-b化SVC155,阴性对照组 pBiFC-b化nVN55(I152L)和地iFC-b化s(deltaZIP)VC155。化η和Fos都是核内癌基因产 物，它们可W通过亮氨酸拉链区发生相互作用，阳性质粒组分别可W表达出完整的化η和 Fos蛋白产生互作后，在细胞内可观察到绿色巧光，阴性质粒组删除了Fos蛋白的亮氨酸拉 链区，两个蛋白不再相互作用，就没有了绿色巧光。结果显示，实验组观察到绿色巧光，因此 我们认为化CHP317和与化AMA1具有相互作用关系，实验结果与Co-IP的结果一致。
[0115] 实施例10用GSTpuU-down技术验证化CHP317基因与化AMA1的相互作用关 系
[0116]GSTPuU-down是一种常用的，在生物体外研究蛋白质相互作用的实验技术。GST PuU-down和免疫共沉淀基本原理相似：细菌表达的谷脫甘肤S-转移酶（GST)融合蛋白 主要用于蛋白的亲和纯化，也可将GST融合蛋白作为探针，与溶液中的特异性搭档蛋白结 合，然后根据谷脫甘肤琼脂糖球珠能够沉淀GST融合蛋白的能力来确定相互作用的蛋白。 一般在得到目标蛋白的抗体前，或发现抗体干扰蛋白质-蛋白质之间的相互作用时，可W 启用GST沉降技术。该方法只用于体外确定蛋白质相互作用。与免疫共沉淀技术相比，GST PuU-down的融合诱巧蛋白在体外系统中表达，可能出现蛋白翻译后修饰不足，由于该实 验是体外研究蛋白质间的相互作用，不能完全反映反映体内蛋白的相互作用。但由于GST PuU-down外源表达系统简便、蛋白表达周期短，且谷脫甘肤和GST融合蛋白亲和性高，易 分离出大量蛋白进行批量实验。目前主要应用于确定融合（或探针）蛋白与未知（或祀） 蛋白间的新的相互作用；W及证实探针蛋白与已知蛋白质间可疑的相互作用。本研究的按 照化ermo提供的操作说明书进行，实验结果用westernblot来检测。结果如图15所示。 由图可知，用GST-317蛋白捕获的I吨ut的westernblot图中只两条条带，所W化CHP317 基因与化AMA1互为互作蛋白，与BIFC的结果一致。
[0117] 实施例11、大肠杆菌（防鸡球虫病的疫苗）的制备方法：
[0118] (1)将上述实施例3所构建的重组表达载体（重组质粒）pGEM-T-EtCHP317在大 肠杆菌中转化：
[0119] 将构建成功的祀T-EtCHP317重组表达质粒，转化大肠杆菌化21 0E3)，接种于至 含5% (质量比）葡萄糖和0.2% (质量比）谷胺酷胺的LB培养基中，37°C，18化pm振荡培 养至细胞密度为109c化/ml,取20mLIPTG诱导上述菌液，4°C离屯、获得菌体沉淀后，加入适 量PBS缓冲液，悬浮均匀，离屯、。用玉米淀粉吸附，具体可为：每克玉米淀粉吸附l〇i°c化疫 苗；得菌粉1。
[0120] 将25重量份的沸石粉与75重量份的玉米淀粉相混合，该沸石粉和玉米淀粉均能 过100目筛；得载体。
[0121] 将菌粉1与上述载体按1: 9的重量比进行混合，简单加W揽拌混合即得防治鸡 球虫病的口服生物制剂；每克该口服生物制剂含有l〇9c化的疫苗1。
[0122] (2)将上述实施例8所构建的重组表达载体（重组质粒）PCDNA3. 1-flag-Et CHP 317在毕赤酵母中转化：
[012引将构建成功的PCDNA3. 1-flag-EtCHP317重组表达质粒，转化毕赤酵母细胞，接 种于至含5% (质量比）葡萄糖和0. 2% (质量比）谷胺酷胺的Yro培养基中，37°C，180巧m振荡培养至细胞密度为l09c化/ml，4°C离屯、获得菌体沉淀后，加入适量PBS缓冲液，悬浮均 匀，离屯、。用玉米淀粉吸附，具体可为：每克玉米淀粉吸附l0i°c化疫苗；得菌粉2。
[0124] 将25重量份的沸石粉与75重量份的玉米淀粉相混合，该沸石粉和玉米淀粉均能 过100目筛；得载体。
[0125] 将菌粉2与上述载体按1:9的重量比进行混合，简单加W揽拌混合即得防治鸡 球虫病的口服生物制剂；每克该口服生物制剂含有l〇9c化的疫苗2。
[0126] 为了取得更好的疫苗保存效果，可W在上述经离屯、、重悬、沉淀的细胞组分中加入 药用辅料，所述的主要为润滑剂和填充剂，且所述润滑剂为总重量的0. 5%~1. 5wt%，填 充剂为总重量的80%~96wt%，其余为细胞组分；所述的润滑剂为：簇甲基淀粉钢、硬脂酸 儀、胶体二氧化娃和滑石一种或两种W上的组合；所