金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种水生动物体液蛋白提取方法，尤其涉及金枪鱼的肌红蛋白的提取 与纯化方法。
【背景技术】
[0002] 金枪鱼是一种大型远洋性重要商品食用鱼，金枪鱼的肉色为红色，这是因为金枪 鱼的肌肉中含有了大量的肌红蛋白所致。肌红蛋白是一种单体血红素蛋白，存在于一些无 脊椎动物的肌肉和大多数脊椎动物的心脏肌和骨骼肌中。在肌肉组织肌浆中肌红蛋白的质 量分数约为〇. 2 %~2 %，相对分子质量为16 000~17000，能可逆地与氧结合，具有转 运和储存氧的作用。铁是人体内不可缺少的一种元素，金枪鱼的血合中含有丰富的铁分和 维生素 B12,易被人体吸收。经常食用，能补充铁分，预防贫血并能作为贫血的辅助治疗食 品。
[0003] 但是现有的专利在金枪鱼血中血红蛋白的提取这方面鲜有报道。本发明旨在发明 一种可以在较短的时间内得到金枪鱼的肌红蛋白，且得率高。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于针对现有技术提供一种可在较短时间获得活性好、得率高、纯 度高、经济价值高的金枪鱼肌红蛋白的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法。
[0005] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化 方法，包括采用金枪鱼肉为原料，其中：从金枪鱼肉中提取肌红蛋白；肌红蛋白的提取过程 均处于糖类混合物的水溶液状态下进行；糖类混合物含有乳糖和海藻糖，且乳糖与海藻糖 重量比为5 :1至1 :5。通过使用糖类混合物作为保护，特定的混合比例可以取得意想不到 的活性保持效果。采用本方法可以获得纯度较高的金枪鱼的血红蛋白，且得率高，有较高的 经济价值。
[0006] 为优化上述技术方案，采取的措施还包括：具有如下步骤： 1) 准确称取一定质量金枪鱼碎鱼肉，加入Tris-HCl缓冲液和糖类混合物后进行抽提， 过滤后取滤液； 2) 将步骤1)滤液于8000-14000r/min离心，除去沉淀，取上清液； 3) 将步骤2)上清液用Imol/LNaOH溶液调整pH至7. 60,加入适当的饱和度的硫酸铵 盐析，静置； 4) 将步骤3)盐析后的沉淀物进行8000-14000r/min离心，沉淀加入Tris-HCl提取缓 冲液溶解，同一缓冲液中透析IOh至24h，使用聚乙二醇经行浓缩； 5) 将步骤4)浓缩后的半成品通过离子交换柱经行纯化。通过以上步骤处理后，可以 得到纯度较高的产品，具有意想不到的高活性特征。金枪鱼的肌红蛋白提取与纯化的过程 均在冰浴中进行。步骤1)中糖类混合物以质量分数计占金枪鱼肉的5-30%。保护试剂在 整个提取体系中起到了很好的抗氧化、防变性的作用。纯化处理的条件为：层析材料选用 DE-AE-S印haroseFF, 0· 01mol/LpH8. 6Tris-HCl 缓冲液与 200mmol/L 的 NaCl 溶液做梯度洗 脱，收集洗脱液。采用层析纯化后可以得到纯度极高的产品，用于特定用途，具有很高的经 济价值。透析处理截取分子量为2000至100000。该分子量区间内的活性物质取得率较高。
[0007] 由于本发明采用了从金枪鱼肉中提取肌红蛋白；肌红蛋白的提取过程均处于糖类 混合物的水溶液状态下进行；糖类混合物含有乳糖和海藻糖，且乳糖与海藻糖重量比为5 : 1至1 :5。通过使用糖类混合物作为保护，特定的混合比例可以取得意想不到的活性保持效 果。采用本方法可以获得纯度较高的金枪鱼的血红蛋白，且得率高，有较高的经济价值。因 而本发明具有可在较短时间获得活性好、得率高、纯度高、经济价值高的金枪鱼肌红蛋白的 优点。
【附图说明】
[0008] 图1为本发明实施例血红蛋白的标准曲线。
【具体实施方式】
[0009] 以下结合附实施例对本发明作进一步详细描述。
[0010] 实施例：金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，包括采用金枪鱼肉为原料，其中： 从金枪鱼肉中提取肌红蛋白；肌红蛋白的提取过程均处于糖类混合物的水溶液状态下进 行；糖类混合物含有乳糖和海藻糖，且乳糖与海藻糖重量比为5 :1至1 :5。通过使用糖类混 合物作为保护，特定的混合比例可以取得意想不到的活性保持效果。采用本方法可以获得 纯度较高的金枪鱼的血红蛋白，且得率高，有较高的经济价值。包括如下步骤： 1) 准确称取一定质量金枪鱼碎鱼肉，加入Tris-HCl缓冲液和糖类混合物后进行抽提， 过滤后取滤液； 2) 将步骤1)滤液于8000-14000r/min离心，除去沉淀，取上清液； 3) 将步骤2)上清液用Imol/LNaOH溶液调整pH至7. 60,加入适当的饱和度的硫酸铵 盐析，静置； 4) 将步骤3)盐析后的沉淀物进行8000-14000r/min离心，沉淀加入Tris-HCl提取缓 冲液溶解，同一缓冲液中透析IOh至24h，使用聚乙二醇经行浓缩； 5) 将步骤4)浓缩后的半成品通过离子交换柱经行纯化。通过以上步骤处理后，可以 得到纯度较高的产品，具有意想不到的高活性特征。金枪鱼的肌红蛋白提取与纯化的过程 均在冰浴中进行。步骤1)中糖类混合物以质量分数计占金枪鱼肉的5-30%。保护试剂在 整个提取体系中起到了很好的抗氧化、防变性的作用。纯化处理的条件为：层析材料选用 DE-AE-S印haroseFF, 0· 01mol/LpH8. 6Tris-HCl 缓冲液与 200mmol/L 的 NaCl 溶液做梯度洗 脱，收集洗脱液。采用层析纯化后可以得到纯度极高的产品，用于特定用途，具有很高的经 济价值。透析处理截取分子量为2000至100000。该分子量区间内的活性物质取得率较高。
[0011] 下面通过进一步的实例进行举例： (1)抽滤：称取58的碎鱼肉中加入4〇!111、0.5111〇1/1、？!1=8.6的1^8-!1(：1缓冲液抽提， 抽提I. 5h后进行抽滤，取滤液。
[0012] (2)离心：滤液于14000r/min超速离心5mim，除去沉淀，取上清液。
[0013] (3)盐析：上清液用Imol/LNaOH溶液调整pH至7. 6,加入饱和度为90%的硫酸铵 盐析，静置lh。
[0014] (4)离心：再次进行超速离心离心条件为r=14000r/min，h=3mim。
[0015] 透析：沉淀加入40ml、0. 5mol/L、pH =8. 6的Tris-HCl提取缓冲液溶解，在同一缓 冲液中透析24h。
[0016] 浓缩：透析后加入20ml的用聚乙二醇经行浓缩。
[0017] 纯化：通过离子交换柱经行纯化，纯化的条件是实验层析材料选用 DE-AE-S印harose FF，0.01mol/L pH8.6Tris-HCl 缓冲液与 200 mmol/L 的 NaCl 溶液做梯度 洗脱，收集洗脱液（每4min收集一管）。
[0018] 二金枪鱼中血红蛋白的含量和纯度的测定 双缩脲法：蛋白质含有多个肽键，可发生有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与铜离子 形成紫红色络合物，可在540nm比色测定，其颜色深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质的 相对分子质量及氨基酸组成无关。因而可以快速测定金枪鱼中血红蛋白的含量。
[0019] 具体测试实验步骤： 双缩脲试剂的配制：称取I. 50g硫酸铜晶体和6. Og酒石酸钾钠，用500ml的水溶解，边 搅拌边下加入300ml、10%的NaOH (100mg/ml)溶液，用水稀释到1L，贮存于塑料瓶中。
[0020] 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0,0. 1，0. 2,0. 3,0. 4,0. 5ml标准 蛋白质溶液（l〇mg/ml)，用蒸馏水补足到lml，然后加入4ml双缩脲试剂。摇匀后室温放置 30min，在540nm处测定吸光度。未加蛋白溶液的第一支试管做空白对照，去两组测定平均 值，以蛋白质含量为横坐标，吸光度为纵坐标做标准曲线。
[0021] 未知样品的测定：取2支试管，分别是透析后的样品和层析洗脱之后的样品，用上 述方法测定样品蛋白质浓度并计算纯度。
[0022] 金枪鱼中血红蛋白的纯度
尽管已结合优选的实施例描述了本发明，然其并非用以限定本发明，任何本领域技术 人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，能够对在这里列出的主题实施各种改变、同 等物的置换和修改，因此本发明的保护范围当视所提出的权利要求限定的范围为准。
【主权项】
1. 金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，包括采用金枪鱼肉为原料，其特征是：从所 述的金枪鱼肉中提取肌红蛋白；所述的肌红蛋白的提取过程均处于糖类混合物的水溶液状 态下进行；所述的糖类混合物含有乳糖和海藻糖，且所述的乳糖与海藻糖重量比为5 :1至 1 :5〇2. 根据权利要求1所述的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征是：包括如下 步骤： 1) 准确称取一定质量金枪鱼碎鱼肉，加入Tris-HCl缓冲液和所述的糖类混合物后进 行抽提，过滤后取滤液； 2)将步骤1)所述的滤液于8000-14000r/min离心，除去沉淀，取上清液； 3) 将步骤2)所述的上清液用Imol/LNaOH溶液调整pH至7. 60,加入适当的饱和度的 硫酸铵盐析，静置； 4) 将步骤3)盐析后的沉淀物进行8000-14000r/min离心，沉淀加入Tris-HCl提取缓 冲液溶解，同一缓冲液中透析l〇h至24h，使用聚乙二醇经行浓缩； 5) 将步骤4)浓缩后的半成品通过离子交换柱经行纯化。3. 根据权利要求2所述的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征是：所述的金 枪鱼的肌红蛋白提取与纯化的过程均在冰浴中进行。4. 根据权利要求2所述的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征是：步骤1)中 所述的糖类混合物以质量分数计占金枪鱼肉的5-30%。5. 根据权利要求2所述的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征是：所述的纯 化处理的条件为：层析材料选用DE-AE-SepharoseFF，0. 01mol/LpH8. 6Tris_HCl缓冲液与 200mmol/L的NaCl溶液做梯度洗脱，收集洗脱液。6. 根据权利要求2所述的金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，其特征是：所述的透 析处理截取分子量为2000至100000。
【专利摘要】本发明公开了金枪鱼的肌红蛋白的提取与纯化方法，包括采用金枪鱼肉为原料，其中：从金枪鱼肉中提取肌红蛋白；肌红蛋白的提取过程均处于糖类混合物的水溶液状态下进行；糖类混合物含有乳糖和海藻糖，且乳糖与海藻糖重量比为5：1至1：5。通过使用糖类混合物作为保护，特定的混合比例可以取得意想不到的活性保持效果。采用本方法可以获得纯度较高的金枪鱼的血红蛋白，且得率高，有较高的经济价值。因而本发明有可在较短时间获得活性好、得率高、纯度高、经济价值高的金枪鱼肌红蛋白的优点。
【IPC分类】C07K14/805, C07K1/14, C07K1/36, C07K1/34
【公开号】CN105399817
【申请号】CN201510687842
【发明人】宋文东, 张鑫, 纪丽丽, 胡世伟, 郭健, 王亚宁, 姜维, 蔡璐
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2016年3月16日
【申请日】2015年10月22日