发明所提供的人工合成的抗虫基因（序列3)的转基因玉米，其 Cry IAh蛋白蛋白的表达量明显提尚，每克（鲜重）叶片中Cry IAh蛋白的表达量可达 3. 18 μ g，而原始基因表达量仅为1.01 μ g。同时，本发明所提供的人工合成的抗虫基因（序 列3)的转基因玉米对革巴标害虫的抗性也明显提高，转入mcryIAh基因的T 6代植株，在玉米 5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转cryIAh基因（优化前，序列2)及非转基因 植株，在接虫后，虫害非常严重。
【附图说明】
[0025] 图 1 为载体 pS3300-UMCT-UMG2、pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的质粒 图谱。其中，A为pS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱；B为pS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为 PS3300-UMG2-UC2A 的质粒图谱。
[0026] 图2为转基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。 其中，A为转基因玉米CrylAh基因的PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 =Marker ;3 : CK (未加 DNA) ;4 :CK (非转基因玉米）；5-24 :转CrylAh基因玉米事件。B为转基因玉米 mCryIAh基因的PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 : CK(非转基因玉米）；5-24:转mCrylAh基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的 PCR检测图谱；I :CK+(质粒阳性对照）；2 :Marker ;3 :CK (未加 DNA) ;4 :CK (非转基因玉 米）；5_ 14 :转CrylAh基因玉米事件；15-24 :转mCryIAh基因玉米事件。
[0027] 图3为转基因玉米苗期草甘膦的耐受性检测结果。
[0028] 图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCrylAh基因 玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0031] 实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得
[0032] 本实施例根据CrylAh全长基因（核苷酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专 利申请：200410009918. 9)编码蛋白的前667个氨基酸序列（前667个氨基酸序列如序列 表中序列8所示，对应的核苷酸序列如序列表中序列2所示），在保证氨基酸序列不变的前 提下，首先采用玉米偏好密码子对CrylAh基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有 密码子，并调整了密码子的使用频率（表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核苷酸序列为 序列表中序列3。序列3与CrylAh基因（序列1)的l-2001bp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原来的37. 4%增加到56. 3%。同时为了便于克隆，在起始密码子后添 加 GGC三个核苷酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcrylAh。密 码子在CrylAh基因和mcryIAh基因中的使用频率见表1。为方便克隆，发明人在序列3的 5'端引入SpeI酶切位点，在3'端引入AatII酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)编码序列表中序列8 所不蛋白，序列3以及序列4的第7-2016位均编码序列9所不蛋白（与序列8所不蛋白相 比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基），将该蛋白命名为CrylAh蛋白。
[0033] 表1玉米优选密码子标准
[0034]
[0036] 实施例2、mcry IAh转基因玉米的获得
[0037] 一、重组表达载体 pS3300-UMG2-UCA 和 pS3300-UMG2-UC2A 的构建
[0038] 为了提高mcrylAh基因（序列3)在受体生物中的表达水平，发明人在构建 mcryIAh基因的重组表达载体时，在mcryIAh基因的5'端添加了 Ω序列和Kozak序列，Ω/ Kozak序列（简称0ΜΚ)如序列表中序列5所示。Ω序列是衍生于植物病毒衣壳蛋白基因 编码区的翻译增强序列，由67bp组成，富集TTAAC序列，5'端有一个UAUUUUUACAACAA序列 以及4个UUAC序列，这些序列在蛋白质合成的翻译过程中构成核糖体和rRNA结合位点。 Kozak序列是促进外源基因在植物细胞内翻译过程的编码核糖体结合蛋白的序列。启动子 选用组成性启动子Ubi启动子，其序列如序列表中序列6所示。再则，在编码序列3'端设计 了 2个连续的终止密码子，以及加入人工合成的PolyA+T-NOS稳定终止序列。PolyA+T-NOS 序列如序列表中序列7所示。其中，PolyA具有维持mRNA稳定等作用，T-NOS终止序列确保 了翻译的准确终止。
[0039] 携带有crylAh和mcrylAh基因的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和 PS3300-UMG2-UC2A的构建具体程序如下：
[0040] a. SpeI和AatII酶切pS3300-UMCT-UMG2质粒（质粒图谱如图1中A所示），回收 大片段。
[0041] 其中，pS3300-UMCT-UMG2质粒的载体全序列如序列表中序列13所示。该质粒中 含有耐草甘膦基因 mG2-aroA (序列10,参见中国专利申请：201210107071. 2)。
[0042] b.人工合成cryIAh基因（序列2)和mcryIAh基因（序列3)，并在两端添加 SpeI 和AatII酶切位点，得到"ACTAGT+序列2+TGA+GACGTC"所示DNA片段以及序列4所示DNA 片段；将这两个DNA片段用SpeI和AatII双酶切后与步骤1回收的大片段进行连接反应， 获得重组表达载体PS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A(两质粒的质粒图谱分别如图1 中B和C所示）。
[0043] 重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的结构描述为：将PS3300-UMCT-UMG2质粒的酶切 位点SpeI和AatII之间的小片段替换为"序列表中序列2+TGA"所示DNA片段后的重组质 粒。
[0044] 重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的结构描述为：将PS3300-UMCT-UMG2质粒的酶 切位点SpeI和AatII之间的小片段替换为序列表中序列3所示DNA片段后的重组质粒。在 该载体上，将含有mcry IAh基因的表达盒命名为Ubi-OMK-mCry IAh-PoIyA-T-NOS ;其序列具 体如序列表中序列11所示。该载体的全序列具体如序列表中序列12所示。
[0045] 二、重组表达载体转化玉米获得转基因玉米
[0046] 1、玉米转化起始材料的获得
[0047] 取玉米HiII授粉后9~13天的幼穗，剥去苞叶，进行表面消毒。从消毒 后的幼穗中剥取幼胚，将其放入感染培养液（配方参考：Methods in Molecular Biology, vol. 343:Agrobacterium Protocols, 2/e, volume I))中清洗一到两次，备用。
[0048] 2、重组表达载体转化农杆菌
[0049] 将步骤一制备的重组表达载体pS3300-UMG2-UCA和pS3300-UMG2-UC2A分别转 化农杆菌 LBA4404(参考文献：Methods in Molecular Biology, vol. 343:Agrobacterium Protocols, 2/e, volume 1)。
[0050] 将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UCA的农杆菌LBA4404命名为 LBA4404/pS3300-UMG2-UCA。将经过鉴定证实转入了重组表达载体pS3300-UMG2-UC2A的农 杆菌 LBA4404 命名为 LBA4404/pS3300-UMG2-UC2A。
[0051] 3、农杆菌转化玉米幼胚
[0052] 将上述步骤1经感染培养液清洗过的幼胚放入OD6。。为0. 3-0. 5左右的上述步骤 2制备的农杆菌的菌液中，放置5分钟，然后将幼胚置于共培养培养基（参考文献：Methods in Molecular Biology, vol. 343:Agrobacterium Protocols,