行分子标记辅助选择，其中包括作为恢复甘蓝型油菜核不育系的育性；
[0018] C、导致临保系的不育，或作为新核不育系，恢复系与临保系选育的分子标记，或者 设计引物扩增出该基因，将该基因克隆到表达载体中，进行不同植物的遗传转化，得到雄性 不育的植株，构建核不育系统，用于杂交育种。其他作物包括利用此 1^#可以导致雄性不 育的其他十字花科植物：白菜，甘蓝，拟南芥，利用方式和甘蓝型油菜相同，都是利用其可以 导致雄性不育的特点。
[0019] 本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
[0020] 根据本发明中报道的序列开发的引物，具有非常特异，以及准确的特点，由于不育 基因即为Bnms4 b，再利用该基因的序列进行的所有分子标记辅助选择，或者克隆该基因进 行不育系统的创建都具有经济，快速，有效的特点。利用该发明保护的基因可以快速地使植 物导致雄性不育，并且可以应用到杂交育种中去，免去了再杂交育种中要大面积大范围地 寻找稳定彻底的雄性不育系的困难，可以随意创建植物的雄性不育系，对于那些还没有在 自然界发现天然的雄性不育的植物来说，无疑是一项革命性的成果。由于其为显性细胞核 雄性不育基因，且已经在拟南芥和油菜中可以导致完全彻底的雄性不育，因此利用它在其 他十字花科植物的不育系统的创建将可以推动其他十字花科植物的杂交育种技术发展，为 培育具有杂种优势的农作物产品提供很好的前提条件。
【附图说明】
[0021] 图1为一种覆盖甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4区段的物理图谱。
[0022] 图示Bnms4b定位于7365A的N07染色体上，利用5050个单株将Bnms4 位于左 右最近的分子标记CL14和DD42锁定的82kb的范围内，括号里的数字代表着该标记的交换 单株，数字越大，说明标记离基因越远，〇表示没有交换，标记为共分离标记。下面一排为不 同标记之间的物理距离。
[0023] 图2为一种用标记筛选BAC池中的单克隆菌落。
[0024] 模板为阳性克隆BAC池稀释一定倍数后长出的单克隆菌落，引物为共分离引物 KZJ301。图3为一种将测序出来的B107和已知的同源BAC序列B80进行序列共线性比对。
[0025] 横纵坐标分别为B107和B80的98kb序列和93kb序列。
[0026] 图4为一种利用RACE技术得到候选基因 CC2的基因结构图。
[0027] 图5为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b的构建图。
[0028] 图6为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b转化拟南芥后，阳性苗的筛选。
[0029] 红色圆圈里面为含有整合基因的阳性苗。
[0030] 图7为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4b转化Col野生型拟南芥的雄性不育表 型。
[0031] a图为野生型拟南芥的开放的花；b图为转Bnms4b基因的拟南芥的开放的花；c图 左边卫可育的花蕾，右边为转Bnms4l^不育的花蕾；d图为去掉花被后的花蕾，左边为可 育，右边为转Bnms4 b的不育花蕾；e图为野生型拟南芥的成熟角果；f图为转Bnms4 b的不育 的角果；g为醋酸洋红染野生型花粉粒，h图为醋酸洋红染转Bnms4%^不育花粉粒。
[0032] 图8为一种表达载体pCAMBIA2300-Bnms4bR化甘蓝型油菜7365C的表型图。
[0033] a为7365C可育植株的花序；b图为同一生长条件下的转基因油菜植株不育花序； c图左为正常的7365C的单株，叶片浓绿，c图右为转基因的油菜单株，叶片有不同程度的白 化发生；d和e也说明了这一结果；f图左为正常的7365C植株，f图右为转基因植株的花 蕾，表面有白色斑块；g图和h图为绿色叶片和白化叶片体视显微镜照相的结果；i图和j图 为剥掉花被的7365C和转基因植株的花蕾。
[0034] 图9为一种利用拟南芥原生质体的Bnms4^码蛋白质定位在质体中的示意图。
【具体实施方式】
[0035] 以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如《分子克隆：实验室指南》（New York:Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)中所述 的条件，或者按照生产厂商提供的操作手册中建议的条件。
[0036] 实施例1 :不育基因 Bnms4的精细定位和染色体着陆
[0037] -种甘蓝型油菜核不育基因 Bnms4b的制备方法，其步骤是：
[0038] 1.实验材料：
[0039] 用于Bnms4b基因图位克隆的近等基因系群体为7365AC，由7365A (Huang et al.，Theor Appl Genet. ,2007，115: 113-118)与 7365C(Xiao et al·，2008， Euphytica，164(2) :377-384),然后与7365C回交，其后代出现了不育与可育的分离，高世 代回交后兄妹交保存，该群体的可育和不育分离比为1 :1，其中不育单株含有Bnms4b基因。 2009年春天在武汉提取的近等基因系7365AC中的5050个可育与不育单株的DNA (提取DNA 的方法参见：Stewart and Via, 1993, 14(5) :748-749)，用于基因的精细定位。
[0040] 2.不育基因 Bnms4的精细定位：
[0041] 根据前面定位的结果，BnmsAit于油菜N7连锁群的SCAR (Sequence characterized amplified region)标记 P4 和 P7 之间(Xia et al. , Theor Appl Genet.，2012, 124(7) : 1193-1200)。即 Bnms4Mi点位于 P4 和 P7 之间。
[0042] 设计的P4和P7引物的核苷酸序列如下所示：
[0043]
[0044] 为了进一步缩小目标基因区域的范围，对Bnms4b进行精细定位，申请人根据目标 区域的序列（以公布的白菜的基因组序列为参考）设计并鉴定出了 Bnms4b的多态性的标 记如图1。分子标记P4和P7在7365AC近等基因系群体的5050个单株中分别检测到15个 和31个交换单株，这些单株在两个标记和Bnms4 b基因间发生了重组（图1)。然后用其余 的标记对交换单株进行分析，发现两侧最近的分子标记是标记CL14和DD42,两个标记分别 有1个和3个单株在标记与Bnms4 b间表现交换，。通过以上精细定位，将Bnms4基因定位 在以甘蓝型油菜的基因组序列为参考的82kb范围内，即分子标记CL14和DD42之间，将所 有标记整合成Bnms4 b的遗传连锁图谱如图1所示。用于精细定位Bnms4 %勺引物的核苷酸 序列见表1所示。
[0045] 表1精细定位Bnms4b的引物的核苷酸序列
[0046]
[0047] 引物名称中最后一个英文字母含义分别为：F为正向引物；R为反向引物。
[0048] 3. BAC文库的构建以及含Bnms4%^ BAC克隆的筛选与测序：
[0049] 精细定位的结果显示BnmsfS因定位在标记CL14和DD42之间，下一步即可将两 个目标基因进行染色体着陆，即筛选含有目标基因的BAC克隆。将含有Bnms4 b基因的油菜 材料7365A，提取其暗光培养12-15天的幼嫩叶片的核DNA，超声波打断后连到特定载体上， 构建出7365A的全基因组BAC(细菌人工染色体，bacterial artifical chromosome, BAC) 文库（构建方法，步骤和试剂见 Luo et al·，2003，Plant Functional Genomics，236:3 -19)，本发明筛选到了 1个含Bnms4b基因的BAC克隆B107(图2)。利用第二代测序技术将 其测通，发现B107为98kb (图3)。
[0050] 从甘蓝型油菜中分离得到一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b，其⑶S序 列为SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列，序列表SEQ ID NO. 1.分离的甘蓝型油菜隐性核不育 基因 Bnms4b的⑶S核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中 的不育株7365A。
[0051] 该基因的启动子一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b，其⑶S序列为SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列。序列表SEQ ID N0. 2.分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b的启动子核苷酸序列，来源于甘蓝型油菜核不育近等基因系定位群体7365AC中的不 育株7365A。
[0052] 该基因编码的蛋白质一种分离甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnms4b，其序列为SEQ ID N0. 3所示的氨基酸序。序列表SEQ ID N0. 3.分离的甘蓝型油菜隐性核不育基因 Bnm