处封闭，整体放到沙浴中加热，在平板上方放上冰，使芘升华后遇平板冷却而附着在固体培养基上。制备好的培养皿置入30°C恒温箱培养，能在固体平板上生长起来的真菌再多次用TOA培养基平板画线经多次划线纯化，纯化后的菌株再用于鉴定和芘降解能力的测定。
[0023]鉴定
(1)平板观察
选取察氏培养基、麦芽汁培养基、PDA培养基，将接种针经火焰灭菌并冷却后，蘸取极少量的孢子，点植于平板的中间位置，将平板置于25°C培养8d，观察菌落的特征并记录。
[0024](2)显微观察
用解剖针从培养皿的菌落上，挑取少许菌体，置载玻片的水滴中，于显微镜下观察其形态特征并记录。
[0025](3)分子鉴定
提取DNA，通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCT-GCCG-3’)(SEQ ID NO: 1)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)(SEQ ID NO:2)扩增整个ITS序列，并进行PCR产物的纯化和克隆，然后由上海生物工程公司完成测序，测序结果经DNAMAN软件去除载体后，把所得的ITSrDNA序列提交到GenBank数据库，利用BLastn工具进行序列比对，对霉菌进行鉴定。
[0026]结果与分析
H3菌在察氏培养基上生长茂盛，菌丝蔓延迅速，菌落白色偏淡黄色，毛状，反面无色(图1);在麦芽汁培养基上比察氏培养基上生长更旺盛，菌丝更密，呈黄色，毛状，与平板结构紧密，用玻璃或接种针很难挑起菌丝，触碰就匍匐倒下，紧密粘在平板上(图2);在察氏酵母培养基上菌落生长比察氏、麦芽汁更旺盛，菌丝淡黄色，7天高度达到培养皿盖，分生孢子囊后期呈白色(图3);孢子囊梗直接由菌丝体生出，单轴式总状分枝，孢子囊着生在囊梗上，孢子球形、椭圆形，圆形(图4)。
[0027]结合上述的平板观察、显微观察和分子鉴定结果，得出如下结论:
本发明筛选到的降解芘霉菌卷枝毛霉H3，ITS rDNA序列长度为612bp，具体的序列为:AAATAAATTTTTGGCTTGTCCATTATTATCTATTTACTGTGAACTGTATTATTACTTGACGCTTGAGGGATGCTCCACTGCTATAAGGATAGGCGATGGGGATGTTAACCGAGTCATAGTCAAGCTTAGGCTTGGTATCCTATTATTATTTACCAAAAGAATTCAGAATTAATATTGTAACATAGACCTAAAAAATCTATAAAACAACTTTTAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGTAGCAAAGTGCGATAACTAGTGTGAATTGCATATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCAACTTGCGCTCATTGGTATTCCAATGAGCACGCCTGTTTCAGTATCAAAACAAACCCTCTATCCAACATTTTGTTGAATAGGAATACTGAGAGTCTCTTGATCTATTCTGATCTCGAACCTCTTGAAATGTACAAAGGCCTGATCTTGTTTGAATGCCTGAACTTTTTTTTAATATAAAGAGAAGCTCTTGCGGTAAACTGTGCTGGGGCCTCCCAAATAATACTCTTTTTAAATTTGATCTGAAATCAGGCGGGATTACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCCGGAGGAAAAGGATCSEQID NO:3)，与卷枝毛霉(Mucor (^1'0；[116110丨(168)的同源性达99.3%，其培养特征及显微形态特征与卷枝毛霉(Mucor (^!'(3；[116110丨(168)最相似。
[0028]卷枝毛霉H3对芘的降解能力一级种子的制取
先从斜面上接种至roA培养基上，培养箱30°C生长10天以上，待表面长满白色的孢子，用无菌勺轻轻刮下表面的孢子，置于含有100mL无菌无机盐培养液中，160r/min，30°C培养3-5天，待孢子球长至2_左右，进入快速生长期，备用，此为一级种子。
[0029]实验过程
用无菌吸管吸取孢子液5mL接种到含芘的25mL的液体培养基中，瓶口用无菌封口培养膜封口(无菌封口培养膜是环凯公司生产的双层膜，上有直径0.6cm的圆孔两个，两层膜的中间有直径3cm的、孔径小于0.2μ的无菌滤纸片，可用于过滤空气)，放置恒温振荡培养箱中160r/min，30°C培养，隔一定的时间取样，每次取3瓶，过滤于烧杯中，转入分液漏斗中，加环己烷7ml振摇萃取2min，滤纸和烧杯用丙酮洗涤，同时洗涤液转入分液漏斗中，洗涤后的孢子烘干至恒重，用以测定菌丝干重。
[0030]具体检测方法
菌丝干重用恒重法，即80°C烘至恒重。
[0031]芘的测定用气相色谱-质谱联用仪(岛津GC/MSQP2010 Plus，日本)对有机相中的芘含量进行测定。色谱条件:进样口无分流模式，进样口温度270 °C;色谱柱型号为DB-5弹性石英毛细管色谱柱(30 mX0.25 mmX0.25 μπι)；柱流量1.65 m L/min;炉温55 °C保持1min，以25 °C/min 升至200 °C，再以 10°C/ min升至240°C保持 0.5 min，最后以30 °C/min升至280°C保持2min。
[0032]结果与分析
本次研究了芘降解霉菌卷枝毛霉H3在30天之内的芘降解能力(图5)，以相同条件下未接种菌种的芘培养液为空白对照，在接种的第8天降解率达到74.52.47%，菌丝干重0.0157g(图6) ; 8至14天，菌丝进入快速增长期，达到0.074g，同事芘的浓度也快速下降，降解率达到93.62%; 14-23天，菌丝干重的增长和芘浓度的下降都进入平缓期，菌丝干重略微下降到0.122g，而芘浓度也有微弱的下降，从14天的0.127mg/L下降到0.122mg/L，芘的降解率为94.08%; 30天，芘浓度继续下降，为0.0772mg/L，降解率也继续增大为95.98%，但菌丝干重则下降，从23天的0.0743g下降到0.0506g。本研究中的芘降解霉菌卷枝毛霉H3无论是对环境中芘的耐受能力和降解能力都是非常强的。一般来说，霉菌降解芘有两条途径:一是菌丝吸附;二是酶促降解，8天前，培养液中的芘对菌丝生长有抑制作用，菌丝生长缓慢;8天-23天，菌丝快速生长，芘浓度也迅速下降，菌丝生长和芘浓度的下降呈反相关，此时菌丝已经适应了环境中芘的浓度，伴随着菌丝的快速生长带来芘的快速下降，降解率达到94.08%，其芘降解的方式应该主要是菌丝吸附；23天-30天，菌丝生长减缓，甚至还出现了少量的自溶，此时假设仅有菌丝吸附，那么培养液中因为菌丝没有再增长，而且还有少量菌丝自溶带来的的芘，芘浓度应该出现少量的增加，但30天的芘浓度却仍然下降道0.0772mg/L，降解率也提高到最高95.98%，由此推断此时应该是菌丝产生了某些降解芘的酶，才导致芘浓度的继续下降。
【主权项】
1.卷枝毛霉H3，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.11578。2.权利要求1所述的卷枝毛霉H3作为PAHs降解剂的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于:PAHs为芘。4.一种降解PAHs的生物制剂，其特征在于:该生物制剂中含有权利要求1所述的卷枝毛霉H3。5.根据权利要求4所述的生物制剂，其特征在于:PAHs为芘。
【专利摘要】本发明公开了卷枝毛霉H3及其在降解芘中的应用，卷枝毛霉H3，保藏于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？No.？11578。实验数据表明卷枝毛霉H3具有降解芘的能力，降解力强，可以用于PAHs的降解，为多环芳烃污染的生物处理工程提供了强有力的帮助。CGMCC No.1157820151103
【IPC分类】A62D101/20, C12R1/785, C12N1/14, A62D101/08, A62D3/02
【公开号】CN105483026
【申请号】CN201511033977
【发明人】黄赛花, 吴启堂, 张朝阳, 黄友良, 何小霞, 卢普相
【申请人】广东省生态环境与土壤研究所
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2015年12月31日