一种利用赤霉菌合成11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及利用一株赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化底物沃氏氧化物为11α，15a-di0H_沃氏氧化物的方法。
【背景技术】
[0002]沃氏氧化物也叫16，17a-环氧-4-孕留烯-3，20-二酮，16，17a-环氧黄体酮或环氧孕酮，是合成留体皮质激素与留体孕激素药物的重要中间体，可以用来合成氢化可的松，乙酸孕酮，醋酸可的松，倍他米松，氯地孕酮，甲地孕酮等。同时，沃氏氧化物也是一种孕激素，在体内对雌激素激发过的子宫内膜有显著的形态学影响，是维持妊娠所需要的物质。其在生物体内能被氧化多种羟基化产物，其中关于1 la-ΟΗ-沃氏氧化物的报道较多，1 la-ΟΗ-沃氏氧化物可用于合成氢化可的松这类皮质激素留体药物。而目前对其lla、15a双羟基产物未有报道。与传统的化学合成方法相比，通过微生物作用以生物转化的方法具有反应步骤少、条件温和、规模生产，以及不污染环境等众多优势。利用微生物转化技术，可选择性的在沃氏氧化物的母核中引入一个或多个羟基位点，从而合成多种留体药物的中间体，用于生产多种抗炎药物。由于留体化合物独特的生物活性和药用价值，国家已把留体激素药物新资源开发作为医药行业近期技术发展的方向和重点之一。
[0003]近些年来，科研工作者已经找到了多株对沃氏氧化物具有转化能力的菌株，如新月弯抱酶(Curvularia lunata)、蓝色犁头霉菌(Absidia coerulea)、黑根霉(Rhizopusnigricans)及雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)等。其均能高效转化沃氏氧化物为11 α-OH-沃氏氧化物，而未见转化生成11 α，15a-di0H_沃氏氧化物的报道，本发明发现利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_1可以转化沃氏氧化物为11α，15a-di0H_沃氏氧化物。11 a，15a-d i 0H_沃氏氧化物的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，而且Cl la、15a双羟化反应作为一种新的留体羟化反应类型，为留体药物合成开辟了新的途径，具有一定的研究价值和市场意义。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种新型的沃氏氧化物双羟基化产物(11a，15a-di0H-沃氏氧化物)以及其转化合成方法。通过两步转化法，利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1转化底物沃氏氧化物为lla，15a-di0H_沃氏氧化物。该菌保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4903，保藏日期为2011年5月24日，分类命名为Gibberella intermedia。
[0005]采用上述微生物转化沃氏氧化物为11α，15a-di0H-沃氏氧化物的方法，其具体步骤如下:
[0006](1)以赤霉菌CA3-1为生产菌株，25?35°C，150?220r/min条件下活化培养得到种子液，然后将种子液稀释涂布到PDA平板上；
[0007](2)制备CA3-1菌株的细胞液体培养物:挑取步骤(1)的PDA固体培养基上的CA3-1菌株一环，接种于已灭菌的装有50?lOOmL种子培养基的500mL锥形瓶中，培养温度为25?35°C，置摇床上以180?220r/min的转速培养12?20h至对数生长中后期，即得到CA3-1菌株的种子培养液；
[0008](3)发酵培养:将步骤(2)中制备好的细胞液体培养物以4%?8% (v/v)的接种量接种于发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装25?50mL发酵培养基，相同条件下培养20?24h，得发酵液；
[0009](4)制备赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株的静息细胞:将步骤(3)中培养好的菌体用0.2M PBS缓冲液洗涤3次，然后重悬于新鲜的30mL/250mL PBS缓冲液。
[0010](5)生物转化:准确称取适量的底物沃氏氧化物，投入步骤(4)中的静息细胞，使其终浓度为4?8g/L，在转化温度28°C，200?220r/min的转速下转化48?72h，即得转化液；[0011 ] (6)产物检测:将步骤(5)的转化液在8000?12000r/min下离心5?lOmin，上清用等体积乙酸乙酯抽提3次，菌体用适量乙醇抽提3次，合并抽提液后于旋转蒸发仪中旋至有晶体出现，乙睛复溶晶体并通过0.22μπι的有机膜过滤除杂，滤液利用高效液相色谱法分析沃氏氧化物、11α，15a-di0H_沃氏氧化物的含量；
[0012]其中步骤(1)中所述的PDA培养基的成分及配比为:土豆200?500g/L;葡萄糖20?50g/L;酵母粉2?10g/L;琼脂粉10?20g/L;pH自然，在121°C高压蒸汽下灭菌20min;步骤
(2)中所述的种子培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;NaCl 0.5?2g/L;KH2P04l?5g/L;调pH至7.0，121°C高压蒸汽灭菌15?20min;步骤(3)中所述的发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;玉米楽1?5g/L;pH自然，121°C高压蒸汽灭菌15?20min。
[0013]本发明所述的利用赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株转化沃氏氧化物为11a，15a-di0H_沃氏氧化物为首次提出。
【附图说明】
[0014]图1为赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株在发酵培养基中转化沃氏氧化物(4g/L)为lla，15a-di 0H_沃氏氧化物的过程研究。
【具体实施方式】
[0015]实施例1制备赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株的种子液
[0016](1)挑取固体PDA培养基上的赤霉菌CA3-1菌株，接种在装有lOOmL种子培养基的500mL锥形瓶中，在30°C下，置于摇床上以200?220r/min的转速培养20?24h至对数期，SP制得赤霉菌CA3-1的种子液。
[0017](2)种子培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;NaCl 0.5?2g/L;KH2P04l?5g/L;灭菌前调培养基的pH 6.5?7.5，在121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0018]实施例2制备赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l菌株的静息细胞
[0019](1)将上述赤霉菌CA3-1菌株的细胞液体培养物以4?8% (w/w)的接种量接种在装有已灭菌的装有30mL发酵培养基的250mL锥形瓶中，在30°C条件下，置于摇床上以200?220r/min的转速培养，培养20?24h。然后，将培养好的菌体用0.2M PBS缓冲液洗涤3次，最后重悬于新鲜的30mL/250mL PBS缓冲液，即得赤霉菌CA3-1菌株的静息细胞。
[0020](2)发酵培养基的成分及配比为:葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;玉米浆1?5g/L;pH 6.5?7.5，121°C高压蒸汽下灭菌20min。
[0021 ] 实施例3赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3-1菌株转化沃氏氧化物
[0022]精确称取适量沃氏氧化物，投入赤霉菌CA3-1菌株的静息细胞，使沃氏氧化物浓度为4?8g/L，在转化温度28°C，200?220r/min的转速下转化48?72h。
【主权项】
1.一株转化沃氏氧化物生成11α，15a-d1H-沃氏氧化物的菌株，该菌株为赤霉菌(Gibberella intermedia)CA3_l，保藏在位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号的中国科学院中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.4903，保藏日期为2011 年5月24日，分类命名为Gibberella intermedia。2.—种利用赤霉菌CGMCC N0.4903转化沃氏氧化物为11α，15a-d1H_沃氏氧化物的方法，其特征为: (1)将赤霉菌作为生产菌种从TOA平板上接入到种子培养基中，25?35°C，150?220r/min条件下培养12?20h，得到种子液;种子培养基的成分及配比为葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;NaCl 0.5?2g/L;KH2P04l ?5g/L;调pH至7.0，121°C高压蒸汽灭菌 15?20min; (2)将种子液以体积百分比4%?8%的接种量接种于发酵培养基，装液量为250mL锥形瓶中装25?50mL发酵培养基，培养温度25?35°C，在150?220r/min转速下培养20?24h，得发酵液;发酵培养基的成分及配比为葡萄糖10?30g/L;酵母粉5?15g/L;玉米浆1?5g/L;pH自然，121°C高压蒸汽灭菌15?20min; (3)称取一定量的沃氏氧化物加入到菌体发酵液中，转化48?72h，即得转化液。
【专利摘要】本发明属生物技术领域，具体涉及利用赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1转化底物沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物的方法。该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.4903。赤霉菌(Gibberella？intermedia)CA3-1能转化沃氏氧化物为11α,15α-diOH-沃氏氧化物，在底物投料浓度为4g/L时，沃氏氧化物转化率高达90％，11α,15α-diOH-沃氏氧化物的得率为68.76％。11α,15α-diOH-沃氏氧化物的合成为甾体药物及其中间体的研究提供了更多元化的前体，具有一定的研究价值和市场意义。CGMCC No.490320110524
【IPC分类】C12P33/06, C12R1/645, C12N1/14
【公开号】CN105483028
【申请号】CN201610017919
【发明人】许正宏, 李会, 史劲松, 倪瑜
【申请人】江南大学
【公开日】2016年4月13日
【申请日】2016年1月12日