G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用及菌株的制作方法
【专利摘要】本发明提供了G6PDH基因在提高黑根霉对甾体C11α-羟基化能力中的应用，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法和构建后筛选获得的菌株。本发明通过分子生物学方法将G6PDH克隆至黑根霉中，改造菌种，拟在改造后的黑根霉细胞内实现G6PDH催化NADPH再生，向细胞色素P450酶系催化的反应提供所需要的辅酶，改善黑根霉对甾体C11α-羟基化的能力。本发明的有益效果主要体现在：按照本发明方法构建的基因工程菌，用于转化沃氏氧化物C11α-羟基化生产霉菌氧化物，相比出发菌株，生长快，原料利用率高，转化率和转化效率高，在甾体药物的开发和利用过程中具有深远的理论意义和较高的应用价值。
【专利说明】G6PDH基因在提高黑根霉对留体Cl 1 α -羟基化能力中的应用及菌株
(-)【技术领域】
[0001]本发明涉及G6TOH基因在提高黑根霉对甾体Cll α -羟基化能力中的应用，以及葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，以及构建并筛选获得的一株留体Cll α -羟基化较高的菌株-黑根霉(Rhizopus nigericans) Pie。
(二)【背景技术】
[0002]氧化还原酶催化合成的产物被广泛应用于医药、食品、农药等领域，酶催化过程中辅酶不足是限制大多数氧化还原酶进行生物催化合成产物的主要因素。因此，辅酶循环再生对于酶催化过程显得非常重要，进而在医药食品等相关的产品生产中体现重大的价值。文献报道辅酶的再生方法包括酶法、光化学、电化学等再生方法，其中尤以酶法再生受到广泛重视。常用于辅酶再生的酶有醇脱氢酶(ADH)、甲酸脱氢酶(FDH)、葡萄糖脱氢酶(⑶H)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、亚磷酸脱氢酶(PTDH)等，其中FDH和⑶H的研究和应用较多，例如，Sheldon 研究 E.coli JM109 (pGDA2)过量表达来自于 Bacillus megateriumIWG3葡萄糖脱氢酶基因，当提供NADP+和葡萄糖时，E.coli JM109 (pGDA2)能够作为NADPH的再生系统。ZhinanXu将Bacillus megaterium ASl.223中的葡萄糖脱氢酶基因gdh223通过克隆构建pQE30-gdh223表达载体，并在大肠杆菌中表达，实现由4-氯乙酰乙酸乙酯到(R) -4-氯-3-羟基丁酸乙酯的转化。相对于FDH和⑶H，G6PDH用于辅酶再生的报道相对较少。
[0003]葡萄糖_6_ 憐酸脱氧酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase, G6PDH,ECl.1.1.49)是戊糖磷酸途径(PPP)氧化阶段中催化第一步反应的酶和PPP代谢途径调控中的一个关键调控酶。G6PDH广泛存在于包括细菌、植物、动物等各种生物细胞中，其催化的反应产生大量的还原型辅酶NADPH，NADPH作为负氢离子供体提供还原力，满足许多细胞代谢过程的需要，如脂肪酸固醇类的合成，光合作用中由CO2合成葡萄糖，核酸合成，维持红细胞中还原型谷胱甘肽水平等，因而G6TOH所催化的反应在还原性生物合成中具有重要的作用。此外，G6TOH还与细胞生长发育，溶血性贫血症、植物胁迫应答、心血管疾病，肿瘤等许多人类疾病有关。
[0004]甾体化合物具有抗炎、抗真菌、免疫抑制、利尿、避孕等作用[76]，临床应用广泛，需求量大，已成为医药行业中仅次于抗生素的第二大类药物，甾体羟基化中C11 α -羟基化是极其重要的留体反应之一，通过C11C1-羟基化引入高生理活性基团，可以显著提高留体药物的疗效，减少副作用，改变作用的专属性等。1952年Peterson和Murry等首次利用黑根霉一步转化实现孕酮C11 α -羟基化生成C11 α -羟基孕酮，促进了可的松药物的的产业化，随后，微生物转化留体在留体药物的生产中越来越受到重视。经过近几十年的研究，黑根霉生物转化留体Cll α -羟基化工艺和技术已相对较成熟，通过诱变育种改善了菌株转化能力，所以在现有菌株和工艺基础上很难继续提高转化率，如何采用新的方法进一步改进菌株的生产能力就成为该领域人员尤为关注的问题。(三)
【发明内容】
[0005]本发明目的是通过分子生物学方法将G6PDH克隆至黑根霉中，改造菌种，拟在改造后的黑根霉细胞内实现G6TOH催化NADPH再生，向细胞色素P450酶系催化的反应提供所需要的辅酶，改善黑根霉对甾体Cll α -羟基化的能力。
[0006]本发明采用的技术方案是:
[0007]葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因在提高黑根霉对留体Cll α -羟基化能力中的应用。
[0008]具体的，所述应用为:构建含有G6PDH基因的表达载体，将其导入黑根霉中，筛选阳性克隆，获得对留体Cll α -羟基化能力提高的基因工程菌。
[0009]具体的，所述G6H)H基因序列如SEQ ID N0.1所示:
[0010]ATGTCGCATGAGGATTATATCCAACGTATCACTCAATATATCAAGGTGCAAGACCCTGAAAAGTTGGAAGCATTCAAACAGATGACATCTTATGTCTCTGGTCAATATGATGAAGATGCCTCTTTCCAAAAGCTGAACGAGGCCATCGAAGCATCTGAAAAGGAAAGAAAGGCCGAAAAGAAAAATCGCGTGTATTATATGGCCCTGCCTCCTTCCGTCTTTATTCCCGTAGCACAAGGATTGAAACGCAATGTGTACACGCCAGAGGGAAGTAACAGGCTGGTGGTCGAGAAACCGTTCGGGATGGACTCTGAATCCTCTGATCATTTAGGTCGTGAATTGGGTGCTCTCTTTACTGAAAATGAGATTTATCGTATTGATCATTATCTCGGTAAAGAGATGGTGAAGAACATCATGAACCTTCGTTTTGCTAATGTCTTACTTGGACATGCCTGGAGTCGTACTTATGTTGATAACGTTCAGATCACGTTCAAGGAACCTTTTGGCACAGAAGGACGGGGTGGTTATTTTGATGAATTTGGCATCATTCGTGATATCATTCAAAACCATTTACTTCAAGTCCTTTCCTTGATTGCTATGGAAAGACCTATCTCTACTGACTCTGAAGCCATTCGTGATGAAAAAGTCAAGGTGTTGAAGTGTATCTCTCCCATTCGTATCGAAGATACCTTGTTGGGTCAAT ATGTTGCTGCTGATGGTAAGCCTGGCTATCTTGAAGATGAAACGCTCAAGAACAAGGACAGTTTGACCCCTACTTTTGCTGCTACTGTTTGTTATGTGAATAATGAACGTTGGGAAGGCGTACCCTTTATCTTGAAGGCAGGTAAGGCCTTGAATGAAGCCAAGGTCGAAGTTCGTCTGCAATTCCACCATGTGGCCGGTAATCTGTTTAGCGGGTCCCCTCGTAATGAGCTCGTCATTCGTATTCAACCCAAAGAGGCTGTGTATTTAAAATTCAACAACAAACAACCTGGTTTGTCCTACGAAACCATTCAGACCGATCTCGACTTGACTTATCACGAACGTTATACTGACCTTGCTATCCCTGACGCTTATGAATCTCTCATCTTGGATGTCTTGCGTAATGATCATTCAAACTTTGTAAGAGATGATGAACTTCAGGCTGCCTGGAAGATCTTTACACCTCTGCTTCACAAGATTGACAAGCATGATTCCGATGTGGATATCAAGACATATGCTTATGGTTCTCGTGGTCCAAAGGAATTGGATGAATTCGTAAAGAAGCATGGTTATCACCGTGATACGAATGGTTACACTTGGCCTGTACAAAATGTAAATCCTTCTTCCAACAAGCTTTAAo
[0011]本发明还涉及一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，所述方法包括:
[0012](I)从米根霉克隆得到其G6PDH基因，将其与质粒PMD19_TSimple连接并转化，得到重组质粒 PMD19-TSimple/G6PDH ；
[0013](2)重组质粒PMD19-TSimple/G6PDH经双酶切后，与质粒PCB1004连接并转化，得到表达载体PCB1004-G6PDH ；
[0014](3)将表达载体？081004_66?0!1溶于溶液4中，使其浓度达到I~5μ g/μ 1，得到质粒溶液；溶液A组成如下:50mM CaCl2,0.3M甘露醇，溶剂为IOmM MOPS (ρΗ6.3)；
[0015](4)每100 μ L黑根霉原生质体溶液加入10 μ L质粒溶液和10 μ L PEG溶液，冰上放置30min后，再加入1.25ml PEG溶液，室温放置30min，得到转化液；所述PEG溶液组成如下:50mM CaCl2,40 ~60% (w/w) PEG4000，溶剂为 IOmM MOPS (ρΗ6.3)；
[0016](5)转化液加入至MYG液体再生培养基，28°C静置培养5~IOh后，所得培养液涂布至MYG固体平板，28°C培养直至出现菌落，转接到含有200~300 μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板上，28°C培养，筛选具有潮霉素抗性的阳性克隆，提取转化子基因组，进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中，鉴定正确后保存。
[0017]所述MYG液体再生培养基组成如下:麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L溶剂为水；所述MYG固体平板组成如下:麦芽糖5g/L，酵母粉5g/L，葡萄糖10g/L，琼脂15g/L，溶剂为水。
[0018]具体的，上述步骤(1)中，所述G6TOH基因序列如SEQ ID N0.1所示。
[0019]本发明还涉及按照上述方法构建并筛选获得的一株留体Cll α -羟基化较高的菌株——黑根霉(Rhizopus nigericans)PIe，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号为=CCTCC No:M2013436，保藏日期为:2013年9月18日。
[0020]本发明的有益效果主要体现在:按照本发明方法构建的基因工程菌，用于转化沃氏氧化物C11 α -羟基化生产霉菌氧化物，相比出发菌株，生长快，原料利用率高，转化率和转化效率高，在留体药物的开发和利用过程中具有深远的理论意义和较高的应用价值。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为米根 霉RNA琼脂糖凝胶电泳图谱；M:DL2000DNA Marker ； Lane 1:米根霉RNA ；
[0022]图 2 为 PCR 扩增的 G6PDH 基因片段；M:DNA Marker ； Lane I:G6PDH ；
[0023]图3为TA克隆的转化子菌落PCR ；M:DNA Marker ；Lane 1-5:5个转化子菌落PCR ；
[0024]图4 为 PMD19-TSimple-G6PDH 质粒及酶切验证；M:DNA Marker ；Lane I ~5:5 个转化子菌落PCR ；
[0025]图5 为测序结果比对；M:DNA Marker ；Lane 1:PMD19_T Simple_G6PDH 质粒；Lane2:BamH I 单酶切；Lane3:Apa I 单酶切；Lane4:BamH I 和 Apa I 双酶切；
[0026]图6为PCB1004-G6PDH真菌整合表达载体构建过程；
[0027]图7为表达载体构建中转化子菌落PCR ；M:DNA Marker ； Lane I~5:5个转化子菌落 PCR;
[0028]图8为表达载体及其双酶切验证；M:DNA Marker ； Lane I:PCB1004质粒；Lane2:PCB1004-G6PDH质粒；Lane3:PCB1004 质粒 BamH I 单酶切验证；Lane4:PCB1004 质粒 Apa I单酶切验证；Lane5:PCB1004 质粒 BamH I 和 Apa I 双酶切验证；Lane6:PCB1004-G6PDH质粒BamH I单酶切验证；Lane7:PCB1004-G6PDH质粒Apa I单酶切验证；Lane8:PCB1004-G6PDH质粒BamH I和Apa I双酶切验证；
[0029]图9为潮霉素抗性筛选的转化子；A:RG3转化子；B:RG12转化子；
[0030]图10 为出发菌株和转化子基因组 DNA ；Μ: λ -Hind III digest DNA Marker ； Lane 1:出发菌株基因组DNA ；Lane2:RG3转化子基因组DNA ；Lane3:RG12转化子基因组DNA ；
[0031]图 11 为 PCR 鉴定转化子；M:DNA Marker ;Lanel:PCB1004_G6PDH 质粒(HPH)；Lane2:PCB1004-G6PDH 质粒(G6PDH) ；Lane3:3 号转化子基因组 DNA (HPH) ；Lane4:12 号转化子基因组DNA (HPH) ;Lane5:3号转化子基因组DNA (G6TOH) ;Lane6:12号转化子基因组DNA (G6PDH) ；Lane7:纯化的HPH片段；Lane8:出发菌株基因组DNA (HPH) ；Lane9:出发菌株基因组DNA (G6PDH)；
[0032]图12为底物和产物HPLC分析。
(五)【具体实施方式】
[0033]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0034]实施例1:相关引物设计
[0035]根据已知的米根霉G6DPH基因序列(SEQ ID N0.l^PE.coli潮霉素抗性基因序列(SEQ ID N0.2)设计引物 F-g6pdh/R-g6pdh 和引物 F_hy g/R-hyg (见表 I),引物 F_g6pdh/R-g6pdh两端分别添加BamH I和Apa I酶切位点，引物F_hyg/R_hyg用于PCR鉴定黑根霉转化子。
[0036]表1:本发明涉及的引物
[0037]
【权利要求】
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)基因在提高黑根霉对留体Cllα -羟基化能力中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用为:构建含有G6PDH基因的表达载体，将其导入黑根霉中，筛选阳性克隆，获得对留体Clla-羟基化能力提高的基因工程菌。
3.如权利要求1或2所述的应用，其特征在于所述G6TOH基因序列如SEQID N0.1所
4.一种葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因工程菌的构建方法，所述方法包括: (1)从米根霉克隆得到其G6PDH基因，将其与质粒PMD19-TSimple连接并转化，得到重组质粒 PMD19-TSimple/G6PDH ； (2)重组质粒PMD19-TSimple/G6PDH经双酶切后，与质粒PCB1004连接并转化，得到表达载体 PCBl004-G6PDH ； (3)将表达载体？081004-66?0!1溶于溶液4中，使其浓度达到I~5μg/μ 1，得到质粒溶液；溶液A组成如下:50mM CaCl2,0.3M甘露醇，溶剂为IOmM MOPS、pH6.3 ； (4)每100μ L黑根霉原生质体溶液加入10 μ L质粒溶液和10 μ L PEG溶液，冰上放置.30min后，再加入1.25ml PEG溶液，室温放置30min，得到转化液；所述PEG溶液组成如下:.50mM CaCl2,40 ~60%PEG4000，溶剂为 IOmM MOPS、pH6.3 ； (5)转化液加入至MYG液体再生培养基，28°C静置培养5~IOh后，所得培养液涂布至MYG固体平板，28°C培养直至出现菌落，转接到含有200~300 μ g/mL潮霉素B的MYG固体平板上，28°C培养，筛选具有潮霉素抗性的阳性克隆，提取转化子基因组，进行PCR确定目的基因片段是否整合到黑根霉基因组中，鉴定正确后保存。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于所述G6PDH基因序列如SEQID N0.1所示。
6.一株甾体Clla-羟基化能力提高的黑根霉工程菌一黑根霉(Rhizopusnigericans)PIe，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:.430072，保藏编号为=CCTCC No:M2013436，保藏日期为:2013年9月18日。
【文档编号】C12N15/80GK103627721SQ201310505530
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年10月22日 优先权日:2013年10月22日
【发明者】陈小龙, 范永仙, 朱廷恒, 薛海龙, 张力伟, 沈寅初 申请人:浙江工业大学