[0024] 进一步，该PCR试剂盒适合于目前存在市场上的所有类型荧光定量基因扩增仪，灵 敏度高，定量快速准确、稳定性好，具有良好的应用前景。
[0025] 进一步，上述荧光定量PCR试剂盒组分包括:特异性引物、内参引物、焚光定量PCR 反应液。其中所述的特异性引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列为SEQ ID N0.1， 下游引物序列为SEQ ID NO. 2。所述内参引物为β-actin内参引物，上游引物序列为SEQ ID NO.3,下游引物序列为SEQ ID NO.4。
[0026] 本发明目的是提供了一种口腔癌检测试剂盒，所述的检测试剂盒检测LRRC26蛋 白。进一步的，所述的试剂盒还包括其他检测试剂。
[0027] 本发明目的是提供了一种检测口腔癌的基因芯片，所述的基因芯片包括与LRRC26 基因的核酸序列杂交的探针。
【附图说明】
[0028] 图1 RT-PCR检测癌组织LRRC26基因表达情况
[0029] 图2转染过表达载体后口腔癌细胞生长曲线
【具体实施方式】
[0030] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本 发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解:在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可 以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限 定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条 件实施检测。
[0031 ] 实施例1
[0032]收集口腔癌及正常组织，对其进行分组及编号：3例正常组织块(编号为N1、N2、N3) 和2例癌组织块、癌旁组织块(Cl、C2和PI、P2)。
[0033]对三组样品进行RNA提取，RNA提取后琼脂糖凝胶电泳。从电泳结果初步认为提取 的RNA样品质量合格，可以用于进一步的转录组分析。进而通过NanoDroplOOO分光光度计检 测RNA样品的提取情况，结果如表1所示。每个样品体积均为SOyl^NA-seq测序的样品要求： 0D260/0D280为 1.8-2.2。1?預0· integrity number)指的是RNA完整性指数，是RNA质量的 重要指标。从表1可以看出，本研究的样品均达到转录组测序的要求。
[0034] 表1 口腔癌RNA样品的分光光度检测
[0035]
[0036] 实施例2高通量转录组测序及分析
[0037] 测序平台：Illumina公司的HiSeq 2500高通量测序平台
[0038] 转录组测序和匹配：
[0039] 我们进行分析的癌变组织、癌旁组织及正常组织3组样品来自于2例口腔癌患者和 3例健康人群。将这两组样品进行高通量cDNA测序。从这3个组织中我们分别得到4.85 X 107，4.91 X 107，4.46 X 107个读段对。我们利用TopHat将读段匹配到UCSC参考人基因组 (hgl9)，唯一匹配的读段对范围在4.04 X 107到4.49 X 107之间，匹配到Ensembl参考基因的 读段比例在81%到89%之间。我们测序深度的平均覆盖度大概为人类基因组的130倍(按照 Ensembl数据库唯一注释的外显子区域的总长度，约为1.13X108)，另外只有1%的读段定 位至IjrRNA，表明我们的数据库构建合理，较可靠地表现带有ployA尾巴的RNA的表达。
[0040] 差异表达基因的分析：
[0041] 为了计算基因的表达从而鉴定出不同样品间的差异表达基因，我们利用Cuffdiff 方法估计基因的表达，从而鉴定表达失调的基因。每个基因的标准化的表达水平按照每一 百万测序片段中匹配到特定基因 lkb长的外显子区域的片段数目（FPKM)计算。
[0042] 差异表达基因的功能富集分析:为了更好的理解差异表达基因的功能，我们对表 达失调的基因进行Gene Ontology的功能富集分析。为了鉴别癌症特异的功能目录，我们利 用在线工具DAVID比较癌变组织、正常组织和癌变组织、癌旁组织的表达显著变化的基因进 行功能富集分析。
[0043]候选基因的选择:从上述RNA-seq测序及深度分析结果中筛选差异表达基因的候 选基因（正常组VS癌变组，癌旁组VS癌变组），排序依据为p-value大小，LRRC26基因进入我 们的研究视野。
[0044] 实施例3癌组织、癌旁组织及正常组织LRRC26基因表达情况
[0045] 一材料和方法 [0046] 1、材料
[0047] 口腔癌自于2010年-2014年住院病例，分别取49例口腔癌患病病人的癌组织、癌旁 组织和23例健康人群正常组织做对照。
[0048] 2、方法
[0049] 2.1 口腔癌组、癌旁组及正常组总RNA的提取
[0050] 按康为世纪超纯RNA提取试剂盒(Ultrapure RNA Kit(DNase I)，货号CW0597)说 明书提取口腔癌组及正常组的RNA，通过凝胶电泳证明RNA的完整性，用核酸蛋白仪测定RNA 的浓度和纯度。
[0051 ] 采用超纯RNA提取试剂盒(货号CW0597)提取，主要操作步骤如下：
[0052] 1.样品处理，30-50mg组织在液氮中充分研磨后加入lml Buffer RLT，或在组织样 品中加入lml Buffer RLT后匀浆处理。
[0053] 2.样品中加入Buffer RLT后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使 蛋白核酸复合物完全分离。
[0054] 3.以每lml Buffer RLT加入200μ1氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15 秒，室温放置2分钟。
[0055] 4. 4°C12，000rpm离心10分钟，此时样品分为三层:红色有机相，中间层和上层无 色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管（自备）中。 [0056] 5.在得到的水相溶液中加入等体积的70 %乙醇(无 RNase的水配制），颠倒混匀。
[0057] 6.将上步所得溶液全部加入到已装入收集管（Collection Tube 2ml)的吸附柱 (Spin Column RM)中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12,OOOrpm离心20秒，倒掉收集 管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0058] 7.向吸附柱中加入350μ1 Buffer RWl，12,000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废 液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0059] 8.配制DNase I混合液：取52μ1 RNase-Free Water，向其中加入8μ110 XReaction Buffer和20μ1 DNase KlU/μΙ)，混匀，配制成终体积为80μ1的反应液。
[0060] 9.向吸附柱中直接加入80μ1 DNase I混合液，20-30°C孵育15分钟。
[0061] 10.向吸附柱中加入350μ1 Buffer RWl，10,000rpm离心1分钟，弃废液，将吸附柱 重新放回收集管中。
[0062] 11.向吸附柱中加入500μ1 Buffer RW2(使用前检查是否已加入无水乙醇），12， OOOrpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
[0063] 12.重复步骤11。
[0064] 13. 12,000rpm离心2分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻 底晾干。
[0065] 14.将吸附柱置于一个新的无 RNase离心管(Collection Tube 1.5ml)中，向吸附 柱的中间部位加入30_50μ1 RNase-Free Water，室温放置1分钟，12，OOOrpm离心1分钟，收 集RNA溶液，-70°C保存RNA，防止降解。
[0066] 15.总1?^完整性鉴定:取2以11?熟样品在1.5%琼脂糖凝胶电泳(8(^，151^11)，分出 区带后，EB染色，紫外灯下观察电泳区带。
[0067] 16.用核酸蛋白仪测定RNA的浓度和纯度。
[0068] 2.2 LRRC26检测引物设计与合成
[0069] 根据PCR引物设计原则，应用Premier 5.0和增强版的OligoArchitect?软件进