冰浴搅拌15min，过滤，用无水乙醚多次洗涤，将沉淀进行真空干燥，得到聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐。
[0036](二)制备去乙酰化透明质酸:
[0037]向9.8X 10—3mol/L的透明质酸水溶液中滴加lmol/L的NaOH溶液，利用pH计检测使溶液pH值为12.65 ± 0.05，缓慢搅拌，使透明质酸与氢氧化钠溶液充分接触，反应2h，得到去乙酰化透明质酸。
[0038](三)透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法:
[0039](I)取预先配制好的第一份人工脑脊液15mL，加热至90°C，加入0.6g氯化钠、
0.015g磷酸钠和2.1g甲基纤维素，搅拌均匀后再加入15mL第二份人工脑脊液，-4°C冰盐浴中搅拌40min，得到甲基纤维素溶液，4°C冷藏过夜；
[0040](2)将聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐配制成浓度为I X 10—3H1VL的水溶液，取2mL加入20mL去乙酰化透明质酸溶液中，搅拌使溶液混合均匀，室温下反应12h，再向溶液中加入质量分数为95%的乙醇至沉淀产生完全，过滤收集沉淀，用乙醇洗涤沉淀3次以上，真空干燥，得到交联活性酯；
[0041](3)称取0.3g交联活性酯加入30mL甲基纤维素溶液中，调节pH至7.4，搅拌2h以上使交联活性酯充分分散且溶解均匀，4°C冷藏过夜，并对其冷冻干燥，得到透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。
[0042]复合凝胶的微观形貌如图1所示，微米尺度下本发明所述的复合凝胶呈现出多孔结构，且孔隙间有连通性，孔径范围在40μηι?60μηι。
[0043]图2给出了未冷冻干燥的复合凝胶在37°C下的流变测试结果。从图中可以看出，随着频率的增大，凝胶的存储模量G’和损失模量G”均逐渐增大，在对数坐标中满足一定的线性关系，此流变学特征与脑组织相似，说明复合凝胶属于假塑性流体，具备可注射性;G’始终大于G”，说明凝胶在37°C时具有类固体性质，体内成胶后具有一定机械强度。升温过程显示复合凝胶的成胶温度为24.3°C，满足体温下成胶的需求。
[0044]体外降解实验中，复合凝胶在3周内的降解率变化如图3所示，从第7天起凝胶的降解率基本稳定在60%，说明在降解速度的控制上，采用交联活性酯为甲基纤维素含量的降低(本例中甲基纤维素含量为7wt%)起到了一定的弥补作用(不加交联剂或仅用未活化聚乙二醇时，维持同等降解率水平一般需要9?llwt%的甲基纤维素)。
[0045]实施例2
[0046]步骤(三)的第(I)步中，氯化钠加入量为1.125g，未加入磷酸钠，其他操作均与实施例I相同。
[0047]图4为本实施例中复合凝胶3周内的体外降解率变化情况(PEG-SS曲线)，凝胶在第I周降解较快，之后降解速度放缓并维持在50?60%的范围内。对比未使用交联剂(Pure曲线)和仅用未活化聚乙二醇交联(PEG曲线)的凝胶，从长期来看，通过交联活性酯进行交联，其降解率明显更低，存留情况较好，有利于所负载的活性分子的持续释放。
[0048]实施例3
[0049]步骤(三)的第(I)步中，氯化钠加入量为1.2g，其他操作均与实施例2相同。
[0050]图5为本实施例中复合凝胶3周内的体外降解率变化情况(PEG-SS曲线)，第3周凝胶的最终降解率仍低于60%，存留情况优于未使用交联剂(Pure曲线)和仅用未活化聚乙二醇交联(PEG曲线)的凝胶。
[0051]上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法，其特征在于，聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，形成透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，具体操作为: (1)将预先配制好的第一份人工脑脊液加热至90°C，加入一定量的氯化钠、磷酸钠和甲基纤维素，搅拌均匀后再加入等体积的第二份人工脑脊液，_4°C冰盐浴中搅拌40min，得到甲基纤维素溶液，4°C冷藏过夜； (2)将聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐配制成水溶液，加入去乙酰化透明质酸溶液中，搅拌使溶液混合均匀，室温下反应12h，再向溶液中加入质量分数为95%的乙醇至沉淀产生完全，过滤收集沉淀，用乙醇洗涤沉淀3次以上，真空干燥，得到交联活性酯； (3)称取一定量的交联活性酯加入甲基纤维素溶液中，调节pH至7.4，搅拌2h以上使交联活性酯充分分散且溶解均匀，4°C冷藏过夜，并对其冷冻干燥，得到透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，氯化钠、磷酸钠、甲基纤维素、去乙酰化透明质酸的质量之比依次为(2?4): (O?0.05):7:1。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐水溶液的浓度为I X 10—3mol/L，与去乙酰化透明质酸溶液的体积比为I: 10。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐的制备方法为: (1)将分子量为6000的聚乙二醇，溶解于二氧六环中，以吡啶作为催化剂，加入琥珀酸酐，加热状态下回流搅拌，反应完毕后冷却，在快速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不再产生，之后置于冰浴中搅拌，过滤后将沉淀充分溶解于二氯甲烷中，再次滴加无水乙醚至沉淀不再产生，冰浴搅拌，将过滤得到的沉淀真空干燥； (2)将步骤(I)得到的沉淀与N-羟基琥珀亚酰胺溶于含有二环己基碳化二亚胺的N，N-二甲基甲酰胺中，搅拌12h后，在快速搅拌下滴加无水乙醚至沉淀不再产生，之后置于冰浴中搅拌，过滤后将沉淀充分溶解于二氯甲烷中，再次滴加无水乙醚至沉淀不再产生，冰浴搅拌，过滤，用无水乙醚多次洗涤，将沉淀进行真空干燥，得到所述的聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，聚乙二醇、琥珀酸酐、吡啶、N-羟基琥珀亚酰胺、二环己基碳化二亚胺的摩尔比依次为1:1:0.695:2.453:2.563;聚乙二醇与各溶剂的质量体积比为聚乙二醇:二氧六环:步骤(I)中所用的二氯甲烷:步骤(2)中所用的二氯甲烷:叱^二甲基甲酰胺=0.488:2011^:3011^:3011^:111^。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(I)中，回流搅拌时的温度为100°C，搅拌时间为4h;步骤(I)和步骤(2)中，两次冰浴搅拌的时间均为:首次搅拌30min，第二次搅拌15min08.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述去乙酰化透明质酸的制备方法为:向透明质酸的水溶液中滴加氢氧化钠溶液，缓慢搅拌，使透明质酸与氢氧化钠溶液充分接触，反应2h，得到去乙酰化透明质酸。9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述透明质酸水溶液的浓度为9.8 X 10—3mol/L，氢氧化钠溶液的浓度为lmol/L;氢氧化钠溶液的添加量以调节pH值至12.65 ± 0.05为准。10.权利要求1-9任一项所述方法制备得到的透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。
【专利摘要】本发明属于生物医用材料及组织工程技术领域，具体涉及一种透明质酸-甲基纤维素复合凝胶的活性酯交联方法。聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酐和去乙酰化透明质酸反应得到交联活性酯，所述交联活性酯与甲基纤维素交联，形成透明质酸-甲基纤维素复合凝胶。本发明所述复合凝胶具有更好的注射性和流变学性能，有利于受损中枢神经的微创修复，减少了对细胞的刺激，具有更好的细胞相容性。
【IPC分类】A61L27/52, A61L27/58, C08J3/24, A61L27/56, A61L27/48, C08L5/08, C08L1/28
【公开号】CN105504316
【申请号】CN201610065326
【发明人】蔡强, 高琴, 卓凡露, 胡堃, 王颖
【申请人】清华大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日