对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的BBM培养基中，设置不同温 度、气体流速、光照条件和培养基初始pH值一系列培养条件进行寻优试验以得出最佳培养 条件；
[0032] (8)高强度驯化培养
[0033]取50ml对数生长期藻液接种到新的反应器6内已灭菌的450ml MBM培养基中，分别 在C〇2浓度为3%、5%、10%、15%、20%、30%、60%和80%及普通空气条件下培养6天时间， 观察微藻的生长情况，考察并记录微藻对高浓度C0 2的耐受性，以筛选获得耐受性相对高的 菌株；
[0034] (9)基因诱变育种
[0035]根据致死率为70-80%有利于正向突变的原则，通过预实验确定适合的诱变剂量 后进行紫外线诱变选育；选择诱变剂量为紫外线照射30min，处理0D680nm分别为0.020、 0.031、0.035、0.046、0.055和0.088的藻液，并根据细胞致死率确定初始藻细胞浓度;上述 不同取值下〇D680nm的每个诱变试验做3个平行样后取其平均值，诱变后预培养同步骤（1) 的预培养过程，然后按照步骤(3)、（4)、（5)筛选出单株优良藻株；
[0036] (10)传代稳定性测定
[0037] 将筛选得到的单株优良藻株分别接种入新的反应器6内新鲜培养液中连续培养四 代，并对第四代藻株测其生长曲线与第一代藻株比较，得到稳定突变株后再进行下个步骤， 否则重复步骤(9)和(10)直至得到稳定突变株；
[0038] (11)基因克隆和测序
[0039] ①菌液与质粒
[0040]将得到的生长稳定的稳定突变株制成菌液，以大肠杆菌(感受态细胞ToplO)和PMG 为质粒载体；
[0041 ]②缓冲液及试剂
[0042] TAE：40mM Tris-acetate,10mM EDTA,
[0043] EB:lgEB溶于100ml蒸馏水中，放于棕色瓶中避光保存，
[0044] 试剂:植物基因组DNA提取试剂盒Plant Genomic DNAKit，普
[0045] 通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒TIANgel Midi Purification Kit;
[0046] ③藻细胞DNA的提取
[0047] 取15ml对数生长期的菌株，在4300g下离心15min后转接到离心管在-20°C条件下 冻结;取出离心管在室温条件下溶解，在12000rmp离心30s，对沉底的组织进行物理破碎;将 65°C预热的700μ1缓冲液GP1转入离心管中迅速颠倒混匀后，放在65°C水浴中20min，该过程 中多次颠倒摇晃以混合样品；加入700μ1氯仿充分混勾，在12000rmp下离心5min;将所得上 层水相转入新的离心管中，加入700μ1缓冲液GP2充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB3 中，12000rmp下离心30s后弃掉废液；向吸附柱CB3中加入500μ1缓冲液GD(使用前加入无水 乙醇），12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放入收集管中；向吸附柱CB3中加入 700μ1漂洗液PW(使用前加入污水乙醇），12000rmp下离心30s后倒掉废液，将吸附柱CB3中放 入收集管中；向吸附柱CB3中加入500μ1漂洗液PW，12000rmp下离心30s后倒掉废液;将吸附 柱CB3中放回收集管中，12000rmp下离心2min后倒掉废液;将吸附柱CB3置于室温放置，以彻 底晾干残余的漂洗液;将吸附柱CB3转入新的干净离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加 50μ1水(pH值在7.0-8.5之间），室温放置2-5min，12000rmp离心2min，将溶液收集到离心管 中；将离心得到的溶液再加入吸附柱CB3中，室温放置2min，12000rmp离心2min得DNA产物， 将DNA产物保存在-20°C，以防DNA降解；
[0048]④引物设计
[0049] 从Genebank中获得菌株的rbcL基因序列，引物设计采用Clustal X 1.8软件进行 分析。按以下原则进行筛选：引物要与模板序列紧密互补，引物间要避免形成稳定的二聚体 或发夹结构，引物特异性要高以避免错误引发，引物Tm值在55-65°C、GC含量在40-60 %，弓丨 物的3'端避免使用碱基T，3'端避免出现3个以上的连续相同碱基，不要在3'端或是离3'端 太近的位置形成二聚体;选择最保守的区域得到引物。
[0050]⑤PCR反应体系和反应条件 [0051 ] 表1 PCR反应体系
[0052]
[0053] 反应循环条件:94°C预变性7min，94°C变性lmin，42°C复性lmin，72°C延伸lmin，共 35个循环，反应最后72°C延伸7min;
[0054] 1ml 的 2XPCR TaqMix 中含有：100nM kcl、20nM Tris_HCL、3nM Mgcl2、400Mm dNTP混合物、O.lU/μΙ Taq DNA聚合酶、溴酚蓝和其他增强剂与稳定剂。
[0055] 取2μ1 PCP产物用于电泳检测，检测是否有明显的目的条带，然后切胶回收目的片 段；
[0056]⑥普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒
[0057]试剂盒组成:平衡液BL，溶胶液ΡΝ，漂洗液PW，洗脱缓冲液ΕΒ，吸附柱CA2，收集管； [0058]⑦PCR产物连接(pBS-T连接试剂盒）
[0059]表2连接反应体系
[0062] 30°C反应2h后，全量转化至T0P10感受态细胞(50μ1)中；
[0063]⑧连接产物的转化
[0064] 将连接反应液10μ1全部转化至50μ1 Τ0Ρ10感受态细胞中，轻轻混匀置于冰上放置 30min;将收集管置于42°C水浴中热激90s，迅速转入冰浴中2min;加入200μ1 LB液体培养 基，37°C、220rmp震荡培养45min;取200μ1上述转化培养物涂至含有Amp (50μg/ml)的LB平板 上，待所有液体被吸收后，37°C倒置培养14h左右，待出现明显而又未相互重叠的单菌落时 取出平板；
[0065]⑨挑取单克隆抗体
[0066] 每个试样挑取20个克隆单体放入离心管中，向离心管中加800μ1含有AMP的LB培养 液，再置于37°C恒温摇床上220rmp培养3h，然后取少量菌液用于PCR检测，其他用于保种和 测序；
[0067] ⑩PCR法检测阳性克隆
[0068] 表3阳性克隆检测的PCR反应体系
[0069]
[0070] 反应循环条件:94°C预变性7min，94°C变性lmin，42°C复性lmin，72°C延伸lmin，共 35个循环，反应最后72°C延伸7min;将在1.2kbp出现条带的菌液用于测序和保种，采用pBS-T载体测序通用引物测序；
[00川 （12)藻株的碳含量测定
[0072]采用全自动元素分析仪分别对原始水样中的藻株和得到的稳定突变株的碳含量 进行测定对比；
[0073] (13)目标株的培养特性测定
[0074] 采用正交试验方式，在实施例1的微藻选育装置中确定出适合目标株的最高耐C02 的浓度、最适宜的培养温度、气体流速、光照条件、初始pH值和对原一系列培养条件；
[0075] (14)确定优选目标株
[0076] 根据上述结果，得到最终优选的目标株。
[0077]经测定分析，本实施例中培育出的目标株具有高C〇2耐受性和固定力，在20%(v/ V)C02时具有最好的生长，固定率高达5.762g/(L · d)，最高C02耐受浓度高达100%(v/v;)其 分类命名:〇11〇^1]^8口.￥-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心， 保藏日期2011年11月14日，保藏编号CGMCC No.5429。
[0078]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此;任何 属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应 涵盖在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种用于高c〇2耐受性和固定率微藻的选育装置，其特征在于主体结构包括c〇 2钢瓶、 空气栗、c〇2分析仪、水浴加热器、纤维膜组件、反应器、光源、三通阀、气体流量计、配气室、I 号管道、π号管道和m号管道，c〇2钢瓶的瓶口处设置有I号管道用于输送c〇2气体，空气栗上 连接有π号管道用于输送空气，π号管道通过三通阀与I号管道连通，I号管道上连通设置 有配气室用于配制来自c〇 2钢瓶和空气栗的气体以形成富含c〇2的气体;配气室下端连通的I 号管道通过三通阀分别与⑶2分析仪和m号管道连通，c〇2分析仪用于测定⑶2的体积浓度， m号管道与反应器密封对接连通用于传送配气室配制后的气体；I号管道和π号管道上均 设置有气体流量计用于控制气流速度，m号管道内部设置有无菌滤膜和纤维膜组件用于过 滤通入的气体，反应器固定放置于水浴加热器中进行恒温水浴加热，反应器的上方固定设 置有配有光照度计的光源以提供稳定的光照强度，从而实现微藻的选育培养。2. 根据权利要求1所述的用于高c〇2耐受性和固定率微藻的选育装置，其特征在于反应 器为内装有培养基的有机玻璃瓶，其侧面均匀涂制有白色涂料以防止侧面光影响，控制反 应器的上层和两侧光照面积总和为反应器自身表面积的6-10%。3. 根据权利要求1所述的用于高C02耐受性和固定率微藻的选育装置，其特征在于纤维 膜组件为内装有纤维膜的中空框架结构式组件，并带有入口和出口；所使用的纤维膜为四 聚丙烯制成的多孔中空纤维，纤维的内外直径分别为0.330mm和0.630mm，孔径为0.2μπι，表 面孔隙率为69 %。
【专利摘要】本发明属于微藻培育技术领域，涉及一种用于高CO2耐受性和固定率微藻的选育装置，CO2钢瓶的瓶口处设置有Ⅰ号管道，空气泵上连接有Ⅱ号管道，Ⅱ号管道通过三通阀与Ⅰ号管道连通，Ⅰ号管道上连通设置有配气室用于配制来自CO2钢瓶和空气泵的气体以形成富含CO2的气体；配气室下端连通的Ⅰ号管道通过三通阀分别与CO2分析仪和Ⅲ号管道连通，Ⅲ号管道与反应器密封对接连通；Ⅰ号管道和Ⅱ号管道上均设置有气体流量计，Ⅲ号管道内部设置有无菌滤膜和纤维膜组件用于过滤通入的气体，反应器固定放置于水浴加热器中进行恒温水浴加热，反应器的上方固定设置有配有光照度计的光源；整体装置设计科学，构思巧妙，原理可靠，操作简单，条件易控，应用广泛。
【IPC分类】C12M1/04, C12M1/00, C12M1/34
【公开号】CN105505756
【申请号】CN201510981320
【发明人】岳丽宏, 陈为公
【申请人】青岛理工大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年12月24日