2,反应溫度为50°C，酶解时间 分别为化，地，化，她，10h，12h，分别进行试验，通过测定甘油二醋的生成率来进行酶解时间 的初步筛选。
[0037] (5)响应面试验因素水平设计
[0038] 表1响应面试验因素水平
[0039]
[0040] (6)响应面试验及其结果： [0041 ]表2响应面方案及结果 [0042]
[0044] (7)响应面回归方程的建立与分析:通过响应面分析软件design expert 8.0.5对 试验结果进行分析后得出其线性回归方程如下：
[0045] Υ = 93.27+2.33A-0.15B+2.11C+0.74D-1.07AB+0.97AC-1.48AD+1.88BC-0.52抓+ 0.12CD-4.38Α2-3.63Β2-3.00C2-2.5 抓2
[0046] 式中Υ表示甘油二醋的生成率，A表示加酶量，Β表示底物比，C表示酶解溫度，D表示 酶解时间。对上述响应面进行方差分析，结果如表3
[0047] 表3响应面方差分析 [004引
[0049]由表3可W看出，回归模型呈现极显著(P<0.01)，模型失拟项为0.0643〉0.05,无显 著性影响，说明方程的拟合程度较好，残差由随机误差引起，模型规定适当，可用回归方程 代替试验真实点对试验结果进行分析，其校正决定系数为0.9110,有91.10%的试验数据的 变异性可用此回归模型来解释。因此，回归方程能较好地描述各因素与响应值之间的关系， 各具体试验因子对响应面值的影响不是简单的线性关系。各因素中4、(：、4 2、82、(：2、02对试验 结果有极显著的影响(P<〇.〇l)，BC对试验结果有显著影响(P<0.05)，4个因素影响的大小关 系是:AX：〉D〉B。
[0050] 使用design experts.ο.5软件处理数据和分析，鸭油甘油二醋最佳条件为：加酶 量1.65%，底物比(甘油:混合脂肪酸)为1: 2.02，酶解溫度为54°C，酶解时间为9.化，在此条 件下甘油二醋的生成率为94.08%。
[0051] 实施例2:酶解鸭油制备甘油二醋最佳工艺条件筛选回归试验
[0052] 按底物比（甘油：混合脂肪酸）1:2.02的比例将混合脂肪酸和甘油加入锥形瓶中， 置于恒溫摇床中，并设定反应溫度为44°C，并加入1.65%固定化南极假丝酵母脂肪酶B，反 应时间为9.化，反应结束后，将酶解液于高速离屯、机中离屯、lOmin，将酶分离，上清液即为高 甘油二醋混合物，中间层为固定化脂肪酶，液相色谱法测定甘油二醋的生成率。
[0053] 通过5次验证试验发现，在该条件下所得甘油二醋生成率依次为93.25 %、 94.09%、93.88%、94.22%、94.17%，平均提取率为93.92%，与实施案例1的结果基本一 致;上述结果表明本发明的工艺具有很好的重复性和稳定性。
[0054] 实施例3:固定化脂肪酶的制备
[0055] (1)固定化载体的预处理:将HPD-800大孔树脂用无水乙醇浸泡12h，抽滤，用蒸馈 水洗至中性，真空干燥至恒重。5 % HC1酸洗12h，5 %化0H碱洗12h，洗至中性，干燥备用。用 pH7.5憐酸缓冲溶液浸泡24h，干燥待用。
[0056] (2)脂肪酶的固定化:按照15.3:1的比例称取载体与脂肪酶，置于锥形瓶中，加入 30血的蒸馈水，于34°C的恒溫摇床中（转速15化/min)吸附化。吸附完成后加入1%的京尼平 交联3.化，之后冷冻干燥，即得固定化的脂肪酶。
[0057] 采用此方法固定的南极假丝酵母脂肪酶B酶活力为固定前的92.3%，且该固定化 的脂肪酶重复使用4次相对酶活仍为80.3%。且使用京尼平作为交联剂，与戊二醒相比更适 合于食品领域。
[0058] (3)固定化脂肪酶稳定性测定
[0059] 1)固定化酶的热稳定性:将固定化的脂肪酶和未固定化的脂肪酶放置于30°C、35 °C、40°C、45°C、50°C、55°C、60°C、65°C、70°C、75°C、80°C 的恒溫水浴锅中化，之后立即放入 4 °C的冰箱中冷却，测定酶活。结果表明：未固定化的脂肪酶和固定化的脂肪酶在40°C耐热性 相差不大，未固定化的脂肪酶40°CW后酶活开始下降，固定化的脂肪酶在50°C酶活才开始 下降，表明固定化的脂肪酶与未固定化的相比具有较好的热稳定性。
[0060] 2)固定化酶的储存稳定性:将固定化的和未固定化的脂肪酶放在4°C冰箱中储存， 测定储存2(1、4(1、6(1、8(1、10(1、12(1、14(1后的酶活，随着时间的延长，游离酶活力明显下降，但 固定化的脂肪酶在储存14d后酶活仍保持87.5%，说明固定化的脂肪酶具有良好的储存稳 定性。
[0061] 3)操作稳定性测定:为了检测固定化脂肪酶的操作稳定性，每次反应后，将酶全部 过滤，有机溶剂清洗干燥后再用来测定酶活。第一次的酶活为100%，此后每次酶活与第一 次酶活相比较，得到相对酶活;检测结果表明，固定化酶重复使用6次时，相对酶活为55%， 说明固定化酶具有很好的操作稳定性。
[0062] 实施例4:未固定化的脂肪酶催化制备鸭油甘油二醋
[0063] 采用未固定化的南极假丝酵母脂肪酶B催化甘油和鸭油混合脂肪酸进行直接醋化 反应。W加酶量1.65%，底物比(甘油:混合脂肪酸)为1:2.02,酶解溫度为54°C，酶解时间为 9.化，5次试验结果为甘油二醋的得率为93.28%，94.05%，95.02%，92.81 %，93.33%，其 反应结果与固定化的脂肪相比较甘油二醋的得率差别不显著;检测结果表明，未固定化的 脂肪酶在产物中含有2%~3%的残留，而固定化的脂肪酶在产物中可W达到100%分离，无 残留。产物中含有一定量的脂肪酶会影响甘油二醋的稳定性，减短其货架期，并且影响产品 质量安全性。
[0064]本发明的方法在传统酶解的基础上，首先对鸭油进行碱法水解制备混合脂肪酸， 然后加入甘油和固定化的脂肪酶进行反应，不仅使反应更加充分，减少了原材料浪费，还在 一定程度上缩短了反应时间，提高了生产效率和甘油二醋的生成率。同时，此项技术避免了 采用高溫、高压工艺造成的能源浪费，避免了化学法大量使用试剂带来的环境和食品的污 染，实现酶与产物分离、重复利用，属于节能、减排和安全工艺的创新。可W直接应用于鸭油 新产品的进一步开发，为鸭脂肪的科学利用提供了一条新的途径，该项技术的推广应用将 具有重大社会推广价值。
【主权项】
1. 一种制备鸭油甘油二酯的方法，其特征在于，所述的方法包括如下步骤： 1) 混合脂肪酸的制备： 将鸭油水溶液在87°C恒温水浴锅中处理1.5h，然后转移至分液漏斗除去下层溶液，在 剩余的溶液中加入lmol/L的NaOH溶液，87°C恒温水解，用NaCI洗涤除去甘油，再用10 %的 HC1酸化至pH2~3，释放游离的脂肪酸； 2) 甘油二酯的制备： 将上述步骤1)中的混合脂肪酸与甘油混合，加入固定化脂肪酶，放置在恒温摇床进行 酶解反应，反应结束后通过离心将酶与底物分离，得到鸭油甘油二酯。2. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中甘油与混合脂肪酸的质量比 为1:2.02。3. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中酶解温度为44°C。4. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中酶解时间为9. lh。5. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中的固定化脂肪酶，其制备方 法如下： 1) 固定化载体的预处理:将HPD-800大孔树脂用无水乙醇浸泡12h，抽滤，用蒸馏水洗至 中性，真空干燥;再用5 %HC1酸洗12h，5 %NaOH碱洗12h，洗至中性，干燥；用pH7.5磷酸缓冲 溶液浸泡24h，干燥待用； 2) 脂肪酶的固定化:按照15.3:1的比例称取大孔树脂与南极假丝酵母脂肪酶B，置于锥 形瓶中，加入30mL的蒸馏水，于34°C的恒温摇床中吸附3h;吸附完成后加入1%的京尼平进 行交联，之后冷冻干燥，即得固定化的脂肪酶。6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中大孔树脂和南极假丝酵母脂 肪酶B的质量比为15.3:1。7. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中1%的京尼平交联时间为 3.2h〇
【专利摘要】本发明涉及一种固定化脂肪酶催化制备鸭油甘油二酯的方法，首先利用碱性水解的方法制得混合脂肪酸，然后将混合脂肪酸与甘油混合，利用固定化的脂肪酶进行催化反应。通过加酶量、底物比、酶解温度、酶解时间四个单因素试验和响应面分析的方法得出固定化的脂肪酶制备鸭油甘油二酯的最佳条件。采用固定化脂肪酶催化鸭油制备甘油二酯，酶与产物甘油二酯可以得到彻底分离，使产品无酶的残留，产品纯度高，保障了食品安全。另外，选用的固定化酶可回收重复利用，降低了生产成本，减少了环境污染。本发明的方法为鸭油副产品综合利用开辟了一新的途径，能够大大提高鸭油的附加值，是一项具有重要开发价值的绿色创新项目。
【IPC分类】C12P7/64
【公开号】CN105506013
【申请号】CN201610061434
【发明人】王宝维, 贺可琳, 葛文华, 张名爱, 岳斌
【申请人】青岛农业大学
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2016年1月29日