常，设计在PCR中使用的引物，从而 该引物y端的至少20个核巧酸与模板完美复性W扩增。通过连接识别位点的相应核巧酸至 引物5'端，添加限制性位点。使用例如由K.Heckman和L.R.化ase，化Uire Protocols(2007) 2,924-932描述的融合PCR作为备选方法W连接两个目的片段，例如，连接启动子至基因或 连接基因至终止子。
[0252]实施例2:双元载体内部装配合成EPA和DHA所需要的基因
[0253] 图2中描述了总体克隆策略：
[0254] 按照图2中描述的模块化克隆方案，由GeneArt (雷根斯堡）合成基因或使用 Phusion?高保真DNA聚合酶(肥B，法兰克福，德国）根据制造商的说明书，从cDNAWPCR扩增 基因。在两种情况下，在5/末端引入Nco I和/或Asc I限制性位点，并在3'末端引入化cl限 审雌位点（图2A)，W便能够使用运些限制性位点，将运些基因克隆在功能性元件如启动子 和终止子之间，从而各基因均与相应的启动子和终止子功能性连接(参见运个实施例中的 下文）。
[0255] 通过W下方式产生启动子-终止子模块：由GeneArt(雷根斯堡)完整合成或使用如 实施例1中所述的融合PCR连接相应的表达元件并且根据制造商的说明书，将PCR产物克隆 至T0P0-载体pCR2.1 (Invitrogen)中（图2B)。将终止子序列结合至启动子序列的同时，将限 制性核酸内切酶Xma I、訊f I、Fse I、Kas I、Fso I、Not I的识别序列添加至图2B中模块的 任一侧，并且将限制性核酸内切酶化0 I、Asc I和化C I的识别位点引入于启动子和终止子 之间（参见图2B)。
[0256] 为了获得最终表达模块，将PCR扩增的基因经Nco巧日/或化C I限制性位点克隆在 启动子和终止子之间或内含子和终止子之间（图2C)。
[0巧7] 使用含有限制性核酸内切酶Xma I、SbfI、Fse I、Kas I、Fso I、Not I的识别序列 的定制多克隆位点（MCS)，将多达3个表达模块根据需要组合，W产生由构建体pENTR/A、 祀NTR/B或祀NTR/C中任一者携带的表达盒（图2D)。
[0巧引最后，使用MultiSite Gateway?系统（invitrogen) W组合由祀NTR/A、祀NTR/B和 祀NTR/C携带的Ξ种表达盒（图沈获得用于植物转化的最终双元Τ质粒。除了用于大肠杆 菌和农杆菌中维持双元质粒的特征外，双元Τ质粒含有乙酷径酸合酶(AHAS)基因 W允许选 择转基因植物。
[0巧9]为了展示本发明增强子的有效性，特别地SEQ ID NO. 20和SEQ ID NO. 46的有效 性，如上文所述那样制备如WO 02102970中所述的基于Conlinin-1启动子的Ξ个不同启动 子-增强子组合(SEQ ID NO. 1-3)(图8)。
[0260] 核酸序列A包含SEQ ID NO. 159的conlinin-1启动子、编码氨基酸序列SEQ ID NO. 11的Δ 5-去饱和酶祀基因和在启动子和祀基因之间与增强子SEQ ID NO.46融合的SEQ ID NO. 140的序列的非翻译区。SEQ ID NO. 1因此包含启动子和UTR直至起始密码子。
[0261] 核酸序列B包含SEQ ID NO. 159的conlinin-1启动子、编码SEQ ID NO. 11的多肤的 Δ 5去饱和酶祀基因和在启动子和祀基因之间根据SEQ ID NO. 324的非翻译区。运个序列缺 少SEQ ID NO.46的本发明增强子的最后24个核巧酸并且完全缺少增强子序列SEQ ID NO.20。相反，SEQ ID NO.46的最后24个核巧酸已经由沈Q ID NO.325的38个核巧酸替换。即 使序列A和序列B具有相似长度，但序列B将本发明的增强子更换为G和T核巧酸数目显著不 同的序列。SEQ ID NO.2因此包含启动子和UTR直至起始密码子。
[0262] 核酸序列C包含SEQ ID NO. 159的conlinin-1启动子、编码SEQ ID NO. 11的多肤的 Δ 5去饱和酶祀基因和在启动子和祀基因之间根据SEQ ID NO. 326的非翻译区。运个序列将 SEQ ID NO.46的本发明增强子的最后24个核巧酸替换为序列乂C"。沈Q ID NO.3因此包含 启动子和UTR直至起始密码子。
[0263] Δ5去饱和酶祀基因将脂肪酸20:3n-6转化成20:4n-6(花生四締酸，ARA)并将20: 4n-3转化成20:5n-3(二十碳五締酸，EPA)。图1中给出反应方案。为了在欧洲油菜种子中提 供Δ 5-去饱和酶报道基因的底物20: 3n-6和20: 4n-3，除分别包含序列A、B或C之外，所述构 建体还包含受处于多种组合的其他种子特异性启动子驱动的去饱和酶基因和延伸酶基因。 W运种方式，确保祀基因的活性和表达不依赖于与去饱和酶基因和延伸酶基因或为提供祀 基因底物所必需的酶的任何相互作用。其中，使用去饱和酶基因和延伸酶基因，其中 dl2dl5Des(Ac_GA)(参见WO 2007042510)、dl2Des(Ce_GA)(参见US 2003172398)、dl2Des (Co_GA2)(参见WO 200185968)、dl2Des(Fg)(参见WO 2007133425)、dl2Des(Ps_GA)(参见WO 2006100241 )、dl2Des(Tp_GA)(参见WO 2006069710)、d6Des(01_febit)(参见WO 2008040787)、d6Des(01_f ebit)2(参见WO 2008040787)、d6Des(0t_f ebit)(参见WO 2008040787)、d6Des(0t_GA)(参见WO 2005083093)、d6Des(0t_GA2)(参见WO 2005083093)、 d抓es(Pir)(参见WO 2002026946)、d6Des(Pir_GAI)(参见WO 2002026946)、d抓es(Plu)(参 见胖0 2007051577)、(1661〇(?9_64)(参见冊 2001059128)、(1661〇(?9_642)(参见胖0 2001059128)、d6Elo(化_GA3)(参见WO 2001059128)、d6Elo(Tp_GA)(参见WO 2005012316) 和d6Elo(Tp_GA2)(参见WO 2005012316)。
[0264]通过W下方式分析Δ 5去饱和酶的活性:如实施例4中所述测量种子中的脂肪酸浓 度并且计算去饱和产物(ARA和EPA)总和除W去饱和酶底物和产物（20:化-6，20: 4n-3、ARA 和EPA)总量，W获得转化效率。运些构建体经常包含ω-3去饱和酶的基因。本发明不激发 ω-3-去饱和酶基因的存在;相应基因的存在回答与本发明不相关的问题。ω-3去饱和酶仅 变动各底物彼此间的比率，W及各产物彼此间的比率；图1中描述了它们的作用模式。因此， ω-3去饱和酶的存在不影响对转化效率的分析，它也不明显地影响祀基因的活性或任何其 他脂肪酸去饱和酶活性。
[0265 ]图3显示本发明构建体中存在的序列的比对。表1中给出了构建体中所用遗传元件 的总结。Δ 5去饱和酶基因序列SEQ ID NO. 10和SEQ ID NO. 12编码相同的多肤序列。去饱和 酶的活性不依赖于任一个基因序列。相反，运些序列可W任意地交换，而不改变对比实验的 结果。
[0266] 表1:遗传元件总结。"P-···":启动子；"d抓es": Δ5去饱和酶；"o3Des": ω-3去饱和 酶
[0267]
[0268] 实施例3:用于产生转基因植物的一般方法
[0269] 通常，根据Moloney等人，1992，Plant Cell Reports,8:238-242的修改方案产生 转基因油巧油菜植物。为产生油巧油菜植物，将实施例2中所述的双元载体转化至根癌农杆 菌 C58Cl:pGV2260(Deblaere 等人，1984，Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788)中。
[0270] 将携带实施例2中描述的双元载体的农杆菌过夜培养物在补充有3 %薦糖的 Murashige-Skoog培养基（3MS培养基）（Murashige和化oog，1962，陆ysiol .Plantl5,473)中 培育。在培养皿中，将无菌油巧油菜植物的下胚轴从过夜培养物获得的1:50稀释的农杆菌 悬液中溫育5-10分钟。随后，在黑暗下25°C在具有0.8%细菌用琼脂的3MS-培养基上共溫育 3天。3天后，将培养物转移到含有500mg/l凯福隆（头抱嚷朽-钢）、100nM咪挫烟 (Imazetapyr)、20微摩尔节氨基嚷岭(BAP)和1.6肖八葡萄糖的MS-培养基上，在运里，将它们 在25°C按16小时光照/8小时黑暗条件培育7天。将正在生长的幼芽(表明存在携带AHAS选择 标记的T-DNA)转移至含有2%薦糖、250mg/l凯福隆和0.8%细菌用琼脂的MS-培养基。可W 通过添加生长激素例如2-吗I噪下酸，刺激生根。
[0271] 已经在含有咪挫烟和凯福隆的2MS-培养基上获得再生的幼芽并且将它们转移至 溫室W进一步发育。在开花后，将成熟种子收获并通过如实施例4中所述的脂类分析法分析 实施例2中所列基因的表达。
[0272] 实施例4:脂质提取和植物油的脂质分析
[0273] 使用叔下基甲酸通过液体/液体提取法，从新鲜或冻干的均化植物材料(种子或子 叶)提取总脂质。
[0274] 用Ξ甲基氨氧化硫鐵衍生化提取的脂质后，通过气相色谱联合火焰电离检测或质 量选择性检测，随后确定所提取脂质的脂肪酸组成。
[0275] 在合适的毛细管柱(50%-氯丙基苯基)-二甲基聚硅氧烷作为固定相)上进行如此 生成的脂肪酸甲醋的气相色谱分离。
[0276] 通过将相应的保留时间和信号强度与具有已知的脂肪酸甲醋组成和含量的标准 溶液的色谱图比较，完成分离的色谱信号鉴定和定量。
[0277] 为了产生含有实施例2中描述的遗传元件的转基因植物W在种子中产生ARA和 EPA，将卡诺拉油菜(欧洲油菜)如实施例3中所述转化。培育选出的含有实施例帥描述的遗 传元件的植物直至成熟种子形成(昼/夜循环:在200mE和21°C下16小时，在黑暗和19°C下8 小时）。从收获的种子提取脂肪酸并且使用气相色谱法进行分析。
[0278] 实施例5:比较含有本发明启动子的构建体与含有非本发明启动子的构建体评价 两种构建体化邮950 =包含569 10顯.2，无任何〇-3去饱和酶；和1邮997 =包含569 10 NO. 1，无任何ω -3去饱和酶），所述构建体在全部遗传元件和构建体布局方面相同，不同在 于驱动报道基因表达的启动子-非翻译区组合。表2显示对两种构建体各自获得的Ξ个独立 转基因植物(事件)的结果。
[0279] 表2:比较因使用两种不同形式的Conlinin启动子所致的转化效率。
[0280]
[0281] 令人惊讶地，与SEQ ID N0:2相比，序列SEQ ID N0:1的使用产生显著更高的转化 效率。
[0282] 实施例6:比较含有本发明启动子的构建体与含有非本发明启动子的构建体
[0283] 评价总计69个构建体，它们全部表达如SEQ ID NO: 11中所显示的Δ 5-去饱和酶蛋 白作为报道基因。该报道基因与SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2或SEQ ID N0:3功能性连接。图3 中描述了运Ξ个启动子形式之间的区别。为了在欧洲油菜种子中提供Δ 5-去饱和酶报道基 因的底物20: 3η-6和20: 4η-3，所述构建体还包含受处于如实施例2和表1中所述的多种组合 的其他种子特异性启动子驱动的去饱和酶基因和延伸酶基因。
[0284] 表3显示，与使用SEQ ID Ν0:2或沈Q ID Ν0:3的构建体相比，使用SEQ ID Ν0:1的 构建体总是显示显著更高的转化效率。运是特别出乎意料的，因为wo 0116340教授了使用 报道基因时与SEQ ID N0:3相似的启动子的用途。
[028引表3:比较因使用不同构建体所致的转化效率;根据SEQ ID NO. 11的Δ 5去饱和酶 是全部构建体的祀基因
[0286]
【主权项】
1. 重组核酸，包含靶基因和毗邻于靶基因的非翻译区，其中非翻译区包含至少18个连 续核苷酸的增强子，其中至少14个核苷酸是腺苷或胞苷。2. 根据权利要求1所述的重组核酸，其中增强子包含根据SEQ ID N0.84、85、86、87、88 或89的任一序列。3. 根据权利要求1或2所述的重组核酸，其中增强子包含以下核苷酸或由以下核苷酸组 成 i) 18个连续核苷酸，其中至少15个、优选地至少17个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优选 地最多1个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 ii) 21个连续核苷酸，其中至少15个、优选地至少16个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多2个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 i i i) 22个连续核苷酸，其中至少16个、优选地至少17个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多2个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 iv) 24个连续核苷酸，其中至少18个、优选地至少19个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多3个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 v) 36个连续核苷酸，其中至少27个、优选地至少28个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优选 地最多6个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 vi) 57个连续核苷酸，其中至少42个、优选地至少45个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多8个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 vii) 83个连续核苷酸，其中至少62个、优选地至少65个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多8个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷。4. 根据权利要求1至3中任一项所述的重组核酸，其中增强子包含根据以下的任一序列 a) SEQ ID NO.20至SEQ ID NO.45的任一序列，或根据以下的任一序列 b) SEQ ID NO.46-83、161-170、221-230、276-285或301-310中任一序列的最后 18、21、 22、24、36或57个核苷酸，或 c) SEQ ID 吣.90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103或137的任一序列， 或 d) 其中插入1个额外碱基的根据b)或c)的序列。5. 重组核酸，其包含植物启动子和毗邻于所述启动子的非翻译区，其中非翻译区包含 至少18个连续核苷酸的增强子，其中至少14个核苷酸是腺苷或胞苷。6. 根据权利要求5所述的重组核酸，其中增强子包含以下核苷酸或由以下核苷酸组成 i) 18个连续核苷酸，其中至少15个、优选地至少17个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优选 地最多1个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 ii) 21个连续核苷酸，其中至少15个、优选地至少16个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多2个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 i i i) 22个连续核苷酸，其中至少16个、优选地至少17个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多2个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 iv) 24个连续核苷酸，其中至少18个、优选地至少19个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多3个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 v) 36个连续核苷酸，其中至少27个、优选地至少28个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优选 地最多6个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 vi) 57个连续核苷酸，其中至少42个、优选地至少45个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多8个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷，或 vii) 83个连续核苷酸，其中至少62个、优选地至少65个核苷酸是腺苷或胞苷，并且最优 选地最多8个核苷酸既不是腺苷，也不是胞苷。7. 根据权利要求5或6所述的重组核酸，其中增强子包含根据以下的任一序列 a) SEQ ID NO.20至SEQ ID NO.45的任一序列，或根据以下的任一序列 b) SEQIDN0.46至SEQIDN0.83中任一序列的最后18、21、22、24、36或57个核苷酸，或 c) SEQ ID 吣.90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103或137的任一序列， 或 d) 其中插入1个额外碱基的根据b)或c)的序列。8. 根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中增强子包含 a) CCAAT框，其包含SEQIDN0.100、优选地包含与SEQIDN0.101具有至少90%同一性 的序列并包含SEQ ID NO. 100,并且更优选地包含SEQ ID NO. 101，和/或 b) DoΠ /MNBla结合位点，其包含SEQIDN0.102、优选地包含与SEQIDN0.103具有至 少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 102,并且更优选地包含SEQ ID NO. 103。9. 根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸，其中靶基因是脂肪酸去饱和酶基因或 延伸酶基因。10. 表达盒，其包含根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸，和，如果尚未包含于 根据前述权利要求中任一项所述的重组核酸中，则还包含植物启动子， 其中所述启动子包含 -TATA框，其优选地包含SEQ ID NO. 108、更优选地包含与SEQ ID NO. 107具有至少89% 同一性的序列并包含SEQ ID NO. 108,并且更优选地包含SEQ ID NO. 107,和 -CPRF因子结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 114、更优选地包含与SEQ ID NO. 113具 有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 114,并且更优选地包含SEQ ID NO. 113,和 -TCP I类转录因子结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 116、更优选地包含与SEQ ID NO. 115具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 116,并且更优选地包含SEQ ID N0.115,和 -bZIP蛋白G框结合因子1结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 118、更优选地包含与SEQ ID NO. 117具有至少85%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 118,并且更优选地包含SEQ ID Ν0·117〇11. 根据权利要求10所述的表达盒，其中启动子还包含以下一个或多个序列： -Ry基序，其优选地包含SEQ ID NO. 110、更优选地包含与SEQ ID NO. 109具有至少88% 同一性的序列并包含SEQ ID NO. 110,并且更优选地包含SEQ ID NO. 109， -谷醇溶蛋白框，其优选地包含SEQ ID NO. 112、更优选地包含与SEQ ID NO. Ill具有至 少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 112,并且更优选地包含SEQ ID NO. 111， -如赋予光诱导性的GAPDH启动子中的顺式元件，其优选地包含SEQ ID NO. 120、更优选 地包含与SEQ ID NO. 119具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 120,并且更优选地 包含SEQ ID NO .119， -SBF-1结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 122、更优选地包含与SEQ ID NO. 121具有 至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 122,并且更优选地包含SEQ ID NO. 121， -向日葵同源域亮氨酸拉链蛋白Hahb-4结合位点，其优选地包含SEQ ID NO. 124、更优 选地包含与SEQ ID NO. 123具有至少90%同一性的序列并包含SEQ ID NO. 124,并且更优选 地包含SEQ ID NO. 123。12. 根据权利要求10或11所述的表达盒，其中启动子包含以下核酸或由以下核酸组成 a) 根据SEQ ID NO. 141、142、144、145、147、148、150、151、153、154、156、157、159至310 中任一序列的核酸； b) 与根据a)的任一核酸序列具有至少70 %序列同一"性的核酸。13. 根据权利要求10至12中任一项所述的表达盒，其包含根据SEQ ID NO. 1的序列或与 SEQ ID NO. 1的序列具有至少70%序列同一性的序列或由根据SEQ ID NO. 1的序列或与SEQ ID NO. 1的序列具有至少70%序列同一性的序列组成。14. 根据权利要求10至13中任一项所述的表达盒，其中靶基因不由根据SEQ ID NO. 311 的序列组成。15. 载体，其包含根据权利要求10至14中任一项所述的表达盒。16. 植物、植物器官或植物细胞，其包含 -根据权利要求10至14中任一项所述的表达盒，或 -与启动子有效连接的根据权利要求1至9中任一项所述的重组核酸。17. 增加靶基因表达或活性的方法，其包括步骤 i) 在靶基因上游提供非翻译区和植物启动子以获得根据权利要求9至11中任一项所述 的表达盒，和 ii) 向植物细胞引入表达盒。18. 根据权利要求1至8中任一项所述的增强子或根据权利要求10至14中任一项所述的 表达盒的用途，用于 -增加靶基因表达或活性， -产生根据权利要求15所述的载体，或用于 -产生根据权利要求16所述的植物、植物器官或植物细胞。
【专利摘要】本发明提供了重组核酸、表达盒、载体、植物细胞、植物器官和植物，其中包括含有靶基因和增强子的转基因核酸。本发明也提供了用于增加靶基因表达或活性的方法，特别地提供了用于在植物细胞或植物器官中增加靶基因表达或活性的方法，以及提供了重组核酸和表达盒增加靶基因表达或活性的用途或用于制备载体、植物细胞、植物器官或植物的用途。所述增强子增加靶基因表达或活性，且靶基因是脂肪酸去饱和酶基因或延伸酶基因。
【IPC分类】C12N15/82, C12N5/04, C12N15/11
【公开号】CN105518133
【申请号】CN201480048830
【发明人】T·森杰, J·鲍尔
【申请人】巴斯夫植物科学有限公司
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2014年7月3日
【公告号】CA2917099A1, EP3017043A2, US20160168584, WO2015001505A2, WO2015001505A3