r>[0033] 表1间接phage-ELISA加样表
[0034]
[0035] 将ELISA阳性克隆送测序公司进行序列测定，得到抗前列腺特异性膜抗原单域重 链抗体噬菌体阳性克隆的插入片段DNA序列，具体为(SEQ ID NO. :2):
[0037] 其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. :1所示：
[0038] QVQLVESGGGLVQAGGSLRLSCVASGRAFRRYTMGWFRQAPGKEREFVATINWSGRNTAYADSVKGRFTISRDSRKN TAYLQMNSLKPEDTAVYYCAQSRAITGGTVPAGYNIWGQGTQVTVSS。即本发明抗前列腺特异性膜抗原 的单域重链抗体，其能与PSMA蛋白的膜外区发生特异性结合。
[0039] 实施例3
[0040] PSMA表达细胞的ELISA和荧光免疫检测
[0041 ] 胃癌细胞MKN45不表达PSMA，而前列腺癌细胞LNCaP表达PSMA，以这两种细胞为例， 采用实施例2中淘选获得的抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆进行细胞 水平的ELI SA和荧光免疫检测。向96孔板中分别种入LNCaP细胞(表达PSMA)和MKN45细胞(不 表达PSMA)各1 X 104个，培养过夜。4%多聚甲醛固定，每孔滴加 lOOyL的3 %过氧化氢液，用 以阻断内源性过氧化物酶活性，37°C孵育30min JBS洗板3次，5 %BSA-roS封闭，加入100yL 抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆，于37°C孵育lh。其后PBS漂洗，添加 HRP-ant i -Ml 3抗体、TMB工作液和0D45Q的测定同实施例2。阳性对照使用噬菌体替代细胞，空 白对照使用PBS替代添加的噬菌体克隆，重复3次。
[0042]向24孔板中的每孔中添加细胞爬片后种入LNCaP细胞和MKN45细胞各4X 105个，培 养过夜。取出爬片，4%多聚甲醛固定，漂洗，滴加3%过氧化氢在爬片表面，用以阻断内源性 过氧化物酶活性。其后TBS洗3次，5 % BSA-PBS封闭30min。滴加100yL展示本发明所述纳米抗 体的噬菌体克隆孵育lh，以不加噬菌体克隆的细胞爬片为空白对照。其后添加稀释度为1: 2000的anti-M13单克隆抗体孵育30min。洗片后滴加30μ1稀释度为1: 200的FITC-山羊抗小 鼠二抗，避光孵育30min，并用DAPI染色液进行复染，置于荧光显微镜下观察。
[0043] 结果表明：由于不表达PSMA的MKN45细胞测值在统计学上与空白对照存在差异，表 明该噬菌体能够与其发生非特异性结合;但是LNCaP细胞测值显著高于MKN45细胞，表明这 一部分差异来自于PSMA和抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆的特异性 结合。同时，细胞免疫荧光表明LNCaP细胞能够与针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体 阳性克隆结合，而MKN45细胞以及未加抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克 隆的细胞爬片为阴性，表明淘选出的抗前列腺特异性膜抗原单域重链抗体噬菌体阳性克隆 能够有效地与PSMA表达阳性的细胞发生特异性结合。
[0044] 实施例4
[0045]抗前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体在大肠杆菌中的表达
[0046] 提取实施例2中针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体阳性克隆的噬菌粒为模 板，设计特异性引物扩增目的基因，扩增条件:94°C5min预变性;94°C30s、55°C30s、72°C40s 共30个循环；最后72°C再延伸5min。结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测，并切胶回收目的片 段。
[0047] 将得到编码本发明所提供的抗前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体的双酶切基 因片段克隆连接到表达载体pET_28a，经测序验证后，得到重组质粒。
[0048]重组质粒转化到大肠杆菌BL21(Rosseta)中，并挑取单菌落进行诱导表达。将单菌 落接种于LB培养基的试管中，37°C振荡培养，过夜活化;次日，按1%的比例转接于新鲜的LB 液体培养基中，37°C、250rpm振荡培养，至0D6QQ约为0.6后，加入终浓度为0.1 mM的IPTG，37 °C、250rpm 诱导 4h。
[0049] 上述诱导的2mL菌液通过8000rpm离心得到菌体，菌体使用无菌roS洗涤3次，并用 lmL无菌PBS进行重悬菌体，冰上超声破碎菌体直至菌液清亮，在4°C下对细胞裂解液进行离 心，离心条件为12000rmp/min，时间为10min，取上清加入5μ1 5XSDS上样缓冲液，沸水煮沸 5min，离心后取上清液进行SDS-PAGE电泳分析并采用镍柱对其进行纯化。
[0050] 通过优化诱导表达条件（如宿主菌、表达载体、诱导时间、诱导温度及IPTG浓度 等），可以进一步提高目的蛋白（单域重链抗体)的表达量，为大量制备抗前列腺特异性膜抗 原的单域重链抗体提供了途径。
[0051 ] 实施例5
[0052]针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体亲和常数的测定 [0053]将实施例4中表达的单域重链抗体采用生物素化试剂盒进行生物素化标记，其后 使用标准的竞争性ELISA技术测定生物素化针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体与实 施例1中重组表达的PSMA蛋白亲和能力。具体步骤为:首先采用InM生物素化的针对前列腺 特异性膜抗原的单域重链抗体分别与13种不同浓度(0.1 nM~100μΜ)的PSMA抗原在EP管中 进行30min孵育;其后，将90yL混合液加入已使用3 %BSA-PBST封闭的、包被有PSMA蛋白的酶 标板中，孵育l〇min后，吸弃反应液，并用PBST清洗;接着，加入100yL稀释度为1: 2000HRP标 记的链霉亲和素，孵育lh后采用PBST清洗5次;TMB工作液的使用和0D45Q的测定同实施例2。 采用非线性回归分析得到〇D 45Q最大值一半时，对应的PSMA浓度，根据抗原-抗体竞争性结合 实验的原理得出生物素化的针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体亲和常数为5 X ΚΓ7/ Μ左右。
[0054]实施例6免疫亲和吸附材料的制备 [0055] 1、免疫亲和磁珠的制备
[0056] 采用纳米磁珠作为载体，偶联针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体后，得到 针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体免疫磁珠，具体制备方法如下：
[0057] 取lmg羧基修饰的磁珠(购自无锡百运纳米科技有限公司，羧基磁珠300nm)于离心 管中，加入500μ1活化缓冲液(1 OmM，NaH2P〇4，pH 6.0)，涡旋混合均匀，磁力架回收磁珠，再用 活化缓冲液洗涤2遍。分别加入2mg碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，涡旋混合后， 静置30min。用偶联缓冲液（10mM，Na 2HP〇4，pH 7.4)洗涤磁珠3遍，加入溶于偶联缓冲液的针 对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体lmg，室温反应3h，用偶联缓冲液洗涤磁珠3次，加入 500μ1含l%(w/v)牛血清白蛋白（BSA)或1% (w/v)卵清蛋白（0VA)的偶联缓冲液封闭未反应 的活性基团，室温反应30min。用偶联缓冲液洗涤磁珠3次，PBS溶液（10mM，pH7.4，0.02%w/ v，Na3N)重悬后保存于4°C。
[0058] 2、针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备。 采用琼脂糖微球作为载体，偶联前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，具体制备方法如下： [0059] 将CNBr活化的干胶用0.1M HC1洗涤10次，每次平衡5min。用偶联缓冲液（10mM， Na2HP〇4，pH 7.4)洗涤10次，加入针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体(2mg/每克琼脂 糖微球），室温反应4h，使针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体与CNBr活化的琼脂糖凝 胶微球共价偶联。用偶联缓冲液（1 OmM，Na2HP〇4，pH 7.4)洗涤2次后，加入封闭液室温反应2h 以封闭未反应的活性基团。用5倍胶体积的磷酸缓冲液（10mM，pH 7.4)和醋酸缓冲液(0.謂， pH 4.0)交替洗涤3次，得到共价偶联了针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体的免疫亲 和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于容量为lml的层析柱，5~10倍柱床体积的 PBS (1 OmM，pH 7.4)洗涤后，加入20 %乙醇溶液，4°C保存。
[0060] 3、针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体免疫亲和吸附材料及亲和柱的制备。 采用硅胶微球作为载体，偶联抗前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，具体制备方法如下： [0061 ] 取2g硅胶微球用纯水和磷酸缓冲液(PBS，10mM，pH 6.0)交替洗涤5~10次，用10ml PBS缓冲液悬浮硅胶微球，加入5mg针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，混匀，加入终 浓度5mg/ml的碳二亚胺(EDC)，迅速混匀，4°C搅拌反应12~24h，得到共价偶联了针对前列 腺特异性膜抗原的单域重链抗体的免疫亲和吸附材料。取0.2ml上述免疫亲和吸附材料于 容量为lml的层析柱，5~10倍柱床体积的PBS(10mM，pH 6)洗涤后，加入含0.02%(w/v)Na3N 的PBS(10mM，pH 6)，4°C保存。
[0062]本发明针对前列腺特异性膜抗原的免疫亲和吸附材料配基为单域重链抗体，具有 SEQ ID N0. :1所示的氨基酸序列，该配基可特异性识别前列腺特异性膜抗原。该单域重链 抗体容易获得、吸附效率高，可以通过生物学方法大量培养生产配基为单域重链抗体，避免 了人工抗体等繁琐生产方法，大大降低了生产成本。具有耐酸碱、耐高温以及易于生产等特 性，这些特性对于前列腺特异性膜抗原的低成本、可重复使用的纯化及免疫学检测方法有 重要的实用价值。
【主权项】
1. 针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，具有SEQ ID NO. :1所示的氨基酸序列。2. -种核酸分子，其特征是编码权利要求1中所述氨基酸序列。3. 根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于序列如SEQ ID NO.:2。4. 一种包含权利要求2所述的核酸序列的载体。5. -种包含权利要求4所述的载体的宿主细胞。6. 权利要求1所述的针对前列腺特异性膜抗原单域重链抗体在免疫检测、菌体或抗原 富集纯化中的应用。7. 权利要求1所述的针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体在制备前列腺特异性膜 抗原免疫检测、富集以及纯化试剂或材料中的应用。8. 权利要求1所述的针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体通过随机或定点突变技 术进行改造所获得的能与前列腺特异性膜抗原特异性结合的抗体。9. 一种针对前列腺特异性膜抗原的免疫亲和吸附材料，包括载体，搭载在载体上的配 基，其特征在于该材料以针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体作为配基，所述针对前 列腺特异性膜抗原的单域重链抗体具有SEQ ID NO.: 1所示的氨基酸序列。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，具体为针对前列腺特异性膜抗原的单域重链抗体，其具有SEQ？ID？NO.1所示的氨基酸序列，可用于免疫检测、抗原富集纯化等领域。本发明所提供的氨基酸序列可以作为前体，通过随机或定点突变技术进行改造，能够获得性质(亲和性、特异性、稳定性等)更好的突变体，用来发展进一步用于医药、工业、农业的蛋白质或多肽。
【IPC分类】B01J20/30, B01J20/28, B01J20/24, C07K16/30, C12N15/13, G01N33/68, G01N33/53, B01D15/38
【公开号】CN105524170
【申请号】CN201610074002
【发明人】涂追, 许杨
【申请人】南昌大学
【公开日】2016年4月27日
【申请日】2016年2月3日