从骨髓中提取免疫细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种从骨髓中提取免疫细胞的方法。
【背景技术】
[0002]骨髓是人重要的免疫器官，含有大量的免疫细胞，在临床应用过程中，常见的问题是很难保证提供足够数量的免疫细胞。目前主要是利用低温冻存技术保存免疫细胞，在需要时复苏并诱导培养为各种免疫细胞。但在分离、冻存过程中，会对单个细胞产生损伤，甚至毒性，尤其是冻存过程中会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，同时伴随生物性损伤的危险。
[0003]另一方面，骨髓中含有较多的脂肪，影响分离效果，不能获得足够的免疫细胞，再加上冻存过程中对细胞产生的损伤，使免疫细胞冻存复苏后的存活率不高。细胞冻存复苏后的存活率通常在70%-90%之间。细胞冻存复苏后的存活率可能会受到细胞采集、分离、冻存等过程的影响。因此，为提供足够量的淋巴细胞，现有技术中细胞冻存复苏后的存活率仍需进一步提高，同时也应避免回输给患者时出现恶心、呕吐或过敏等不良反应，提高安全性。现有技术中，常规的FicolI 400分离液对细胞具有一定的毒性，不利于临床应用。
[0004]因此，有必要提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的提取方法。
【发明内容】
[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种能够有效提高免疫细胞分离率和细胞冻存复苏后的存活率、提高回输到患者的细胞的安全性的从骨髓中提取免疫细胞的方法。
[0006]为解决上述技术问题，本发明提供技术方案如下:
[0007]—方面，提供一种从骨髓中提取免疫细胞的方法，包括如下步骤:
[0008]I)采集人骨髓，用含15 %胎牛血清的α-ΜΕΜ培养液5倍稀释，400g，5min离心，弃上清及脂肪层，获骨髓细胞；
[0009]2)将外周血移入离心管中，750g，10min离心，吸取上层血浆备用，下层细胞用于分离外周血淋巴细胞;所述骨髓细胞中加入含15%上述上层血浆的α-ΜΕΜ培养液制成细胞悬液；
[0010]3)将含有海藻糖，超低粘度海藻酸钠和泛影酸钠的分离液加入到离心管中；
[0011]4)将所述细胞悬液平铺到所述离心液上，在8-25°(3，50(^-80(^，10?301^11条件下离心，吸取白膜层细胞获得免疫细胞；
[0012]5)将所述免疫细胞等体积加入到冻存液中混匀，分装于细胞冻存管中，将所述细胞冻存管放置于程序冻存盒中，先于_80°C冷冻，然后转入液氮中冻存。
[0013]本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力;本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高;本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应;本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带;本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分呙。
[0014]进一步地，所述步骤5)中冻存液的配方为10%DMS0+5%右旋糖酐+5%海藻糖+18%所述上层血浆+62%注射用生理盐水的混合溶液。
[0015]进一步地，所述步骤2)细胞悬液的浓度为I?6X 16细胞/ml。
[0016]进一步地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的右旋糖酐3?5重量份，海藻糖2?4重量份，超低粘度海藻酸钠0.3?0.8重量份，泛影葡胺I?3重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.1?0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μπι滤膜过滤制得分离液。
[0017]本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品;海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离；聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离;本发明的分离液中的各组分配比合理从而起到良好的分离效果。
[0018]进一步地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的右旋糖酐3.5?4.5重量份，海藻糖2.5?3.5重量份，超低粘度海藻酸钠0.4?0.8重量份，泛影葡胺1.5?2.5重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.12?0.15重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μπι滤膜过滤制得分离液。
[0019]优选地，所述分离液的制备方法为:将符合药用标准的右旋糖酐4重量份，海藻糖3重量份，超低粘度海藻酸钠0.7重量份，泛影葡胺2重量份和聚二烯丙基二甲基氯化铵0.13重量份充分溶解于灭菌注射用水配制成生理溶液100重量份，再经过0.22μπι滤膜过滤制得分离液。
[0020]进一步地，所述分离液的密度为1.070?1.09(^/0113，渗透压为275?300811101/1^，pH为6?9，粘度为3.0?5.0cp。
[0021 ] 进一步地，所述右旋糖酐为Dextran70。
[0022]综上所述，本发明的有益效果表现为:
[0023]本发明可以使用外周血的自体血浆用于骨髓免疫细胞的分离、冻存，外周血的下层细胞也可以用来分离淋巴细胞用于提高患者免疫力;本发明从预处理到分离再到冻存均选用符合静注级原料药标准的原料，原料不确定性小，安全性高;本发明使用外周血的上层血浆用于骨髓细胞的悬浮液制备，并作为冻存液的一部分，有效减少回输过程的免疫排斥反应;本发明的分离液对骨髓细胞进行离心处理后，免疫细胞在分离介质和血浆的交界面形成比较明显的云雾状细胞条带;本发明采用的右旋糖酐(Dextran)是一种分支化的葡聚糖，其通过一些乳酸菌合成，典型地包括串珠菌和变形链球菌。临床上常用的有中分子右旋糖酐，主要用作血浆代用品；海藻糖又称漏芦糖、蕈糖等，是一种安全、可靠的天然糖类；由两个葡萄糖分子以I，1-糖苷键构成的非还原性糖，对多种生物活性物质具有非特异性保护作用，对单个核细胞起到一定的保护作用;超低粘度海藻酸钠具有较低的粘度，较多的羟基有助于免疫细胞的分离;聚二烯丙基二甲基氯化铵为强阳离子聚电解质有助于免疫细胞的分离。
【具体实施方式】
[0024]为使本发明的实施例要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施例进行详细描述。但本发明绝非限于这些例子。以下所述仅为本发明较好的实施例，仅仅用以解释本发明，并不能因此而理解为本发明专利范围的限制。应当指出的是，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。因此，本发明专利的保护范围应以所