腺癌细胞增殖能力的影响。
[0058] 具体的实施方式
[0059] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0060] 实施例1筛选与直肠腺癌相关的基因标志物
[0061] 1、样品收集
[0062] 各收集8例直肠腺癌癌旁组织和直肠腺癌组织样本。上述样本为直肠腺癌患者的 手术切除标本，上述所有标本的取得均通过组织伦理委员会的同意。
[0063] 2、RNA样品的制备(利用E.Z.N.A._iRNA kit进行操作）
[0064] 上述获得的组织剪碎后投入液氮中并研磨至粉末状，按照试剂盒中的说明书提取 分离RNA。具体如下：
[0065] (l)RNA 的分离：
[0066] ①组织匀浆或细胞中加入RNA-Solv⑩Reagent II 1ml;
[0067] ②室温放置3min，加入0.2ml氯仿后剧烈摇动15s;
[0068] ③置于冰上防止lOmin;
[0069] ④ 12000g，4°C 离心 15min;
[0070] ⑤转移80%的水相进入新的2ml EP管中，加入1/2量的无水乙醇，振摇；
[0071 ] ⑥将小于700μ1的上述液体转移至HiBindS.RNA Mini column，振摇后10000g室温 离心60s 〇
[0072] (2)RNA 纯化：
[0073] ①向 HiBind?:RNA Mini column加入500μ1 RWC Wash Buffer，lOOOOg离心30s;
[0074] ②加入500μ1 RWB Wash Buffer，lOOOOg离心30s，重复两次后米取最大离心完全 干燥HiBindSRNA Mini column;
[0075] ③向柱子加入15μ1预热至70°C的DEPC水，室温放置2min后全速离心。
[0076] 3、高通量转录组测序
[0077] (l)RNA-seq 读段定位
[0078] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用TopHat vl. 3.1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组(hgl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从TopHat主页下载，并作为参考基因组，利用TopHat与基因组匹配时，允许每个读段(默认 到20)有多个匹配位点，最多2次错配。TopHat根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的 剪切位点库，根据这些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用 TopHat方法的系统默认参数。
[0079] (2)转录丰度评估
[0080]匹配上的读段文件通过Cufflinks vl.0.3处理，Cufflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因 lkb长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRCh37·63·gtf)〇 [0081 ] (3)差异表达基因的检测
[0082] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在Cuff idff输出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0083] 4、结果
[0084] RNA-seq结果显示，FAM176A基因在直肠腺癌组织中的表达量显著低于癌旁组织中 的表达量。
[0085] 实施例2 QPCR测序验证FAM176A基因的差异表达
[0086] 1、对FAM176A基因差异表达进行大样本QPCR验证。按照实施例1中的样本收集方式 选择直肠腺癌癌旁组织和直肠腺癌组织各70例。
[0087] 2、QPCR具体操作步骤如下所示：
[0088] (l)RNA 提取
[0089] RNA提取步骤如实施例1所述。
[0090] (2)逆转录:使用TAKARA公司的反转录试剂盒进行操作。具体步骤如下：
[0091] ①取总RNA lyg进行逆转录，加入01 igo(dT)2μ1，充分混匀。70°C水浴5min后立即 冰浴2min。
[0092] ②构建25μ1反应体系，其中包括5X逆转录缓冲液5yl，dNTP(2.5mM)5yl，RNasin 4〇υ/μ1，M-MLV 20〇υ/μ1，补无核酸酶水至预期体积。
[0093] ③ 42°C 水浴 60min 后，95°C 水浴 5min 以灭活 M-MLV。
[0094] ④-20°C储存备用。
[0095] (3)QPCR 扩增
[0096] ①引物设计
[0097] 根据Genebank中GAPDH基因和FAM176A基因的编码序列设计QPCR扩增引物，由上海 生工生物工程技术服务有限公司合成。具体引物序列如下：
[0098] GATOH基因：
[0099] 正向引物为5'-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3'（SEQ ID N0.3);
[0100] 反向引物为5'-GGTGGAATCATATTGGAACA-3'（SEQ ID N0.4)。
[0101] FAM176A 基因：
[0102] 正向引物为5'-CCTATTCCTTTGTCTCAG-3'（SEQ ID N0.5);
[0103] 反向引物为5'-AGATCCTTATCACCAGAG-3'（SEQ ID N0.6)。
[0104] ②按照表1配制PCR反应体系：
[0105] 其中，SYBR Green聚合酶链式反应体系购自Invitrogen公司。
[0106] ③PCR反应条件：95°C10min，（95°C30s，60°C40s) X40个循环。以SYBR Green作为 荧光标记物，在Light Cycler荧光定量PCR仪上进行PCR反应，通过融解曲线分析和电泳确 定目的条带，△△ CT法进行相对定量。
[0107] 表1 PCR反应体系
[0109] 3、统计学方法
[0110] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是以平均值土标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P〈0.05时具 有统计学意义。
[0111] 4、结果
[0112] 结果如图1所示，与直肠腺癌癌旁组织相比，FAM176A基因在直肠腺癌组织中下调， 差异具有统计学意义(P〈〇.〇5)，同RNA-sep结果一致。
[0113] 实施例3 FAM176A基因的过表达
[0114] 1、细胞培养(人直肠腺癌细胞HRC-99)
[0115] (1)用含10%小牛血清和1%?/3的1^]\〇1640培养基在37°(3、5%邙2、相对湿度为 90 %的培养箱中培养细胞。
[0116] (2)当细胞长至70 % -90 %时，用0.25 %含EDTA的胰蛋白酶常规消化传代。
[0117] (3)每2-3天进行传代培养。
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