与子宫肌瘤相关的基因标志物的制作方法_2

文档序号:9780875阅读:来源:国知局
宿主细胞是真核细胞,如C册细胞、COS细胞等。
[0028] 本发明还提供了一种用于治疗子宫肌瘤的药物组合物,所述药物组合物包括上面 所述的TLR3基因和/或其表达产物的促进剂。
[0029] 进一步,本发明的药物还包括药学上可接受的载体,载体,运类载体包括(但并不 限于):稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、薦糖等;粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明 胶和聚乙締化咯烧酬;湿润剂如甘油;崩解剂如琼脂、碳酸巧和碳酸氨钢;吸收促进剂季锭 化合物;表面活性剂如十六烧醇;吸附载体如高岭±和皂粘±;润滑剂如滑石粉、硬脂酸巧 和儀、聚乙二醇等。
[0030] 本发明的药物导入组织或者细胞的方式可W分为体外或者体内的方式。体外方式 包括将含有化R3基因的药物或者含有化R3蛋白质的药物导入细胞中,再将细胞移植或回输 到体内。体内方式包括直接将含有化R3基因的药物或者含有化R3蛋白质的药物注入体内组 织中。
[0031] 本发明的药物还可与其他治疗子宫肌瘤的药物联用,多种药物联合使用可W大大 提到治疗的成功率。
[0032] 在本发明的上下文中,叮LR3基因"包括化R3基因 W及化R3基因的任何功能等同物 的多核巧酸。TLR3基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中化R3基因(NC_ 000004.12)DNA序列具有70% W上同源性,且编码相同功能蛋白质的DM序列;
[0033] 优选地,TLR3基因的编码序列包括W下任一一种DNA分子:
[0034] (1)序列表中沈Q ID N0.1所示的DNA序列;
[0035] (2)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA序列;
[0036] (3)与(1)或(2)限定的DNA序列具有70 %、优选地,90 % W上同源性,且编码相同功 能蛋白质的DNA分子。
[0037] 在本发明的具体实施方案中,所述化R3基因的编码序列是SEQ ID NO. 1所示的DNA 序列。
[0038] 在本发明的上下文中,TLR3基因表达产物包括化R3蛋白W及化R3蛋白的部分肤。 所述TLR3蛋白的部分肤含有与子宫肌瘤相关的功能域。
[0039] 叮LR3蛋白"包括化R3蛋白W及化R3蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括 化R3蛋白保守性变异蛋白质、或其活性片段,或其活性衍生物,等位变异体、天然突变体、诱 导突变体、在高或低的严紧条件下能与TLR3的DNA杂交的DNA所编码的蛋白质。
[0040] 优选地,TLR3蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白质:
[0041] (1)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质;
[0042] (2)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺 失和/或添加且与SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由SEQ ID NO.2所示的氨 基酸序列衍生的蛋白质。取代、缺失或者添加的氨基酸的个数通常为1-50个,较佳地1-30 个,更佳地1-20个,最佳地1-10个。
[0043] (3)与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列具有至少80%同源性(又称为序列同一性), 更优选地,与SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列至少约90%至95%的同源性,常为96%、97%、 98 %、99 %同源性的氨基酸序列构成的多肤。
[0044] 在本发明的具体实施方案中,所述化R3蛋白是具有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列的蛋白质。
[0045] 通常,已知的是,一个蛋白质中一个或多个氨基酸的修饰不会影响蛋白质的功能。 本领域技术人员会认可改变单个氨基酸或小百分比的氨基酸或对氨基酸序列的个别添加、 缺失、插入、替换是保守修饰,其中蛋白质的改变产生具有相似功能的蛋白质。提供功能相 似的氨基酸的保守替换表是本领域公知的。
[0046] 通过添加一个氨基酸或多个氨基酸残基修饰的蛋白质的例子是化R3蛋白的融合 蛋白。对于与TLR3蛋白融合的肤或者蛋白质没有限制,只要所得的融合蛋白保留TLR3蛋白 的生物学活性即可。
[0047] 本发明的化R3蛋白也包括对SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的非保守修饰,只要 经过修饰的蛋白质仍然能够保留化R3蛋白的生物学活性即可。在此类修饰蛋白质中突变的 氨基酸数目通常是10个或者更少,例如6个或者更少,例如3个或者更少。
[0048] 在本发明的上下文中,"诊断子宫肌瘤"既包括判断受试者是否已经患有子宫肌 瘤、也包括判断受试者是否存在患有子宫肌瘤的风险。
[0049] 在本发明的上下文中,"治疗子宫肌瘤"从疾病的状态变化来分,可W包括疾病的 缓解、疾病的完全治愈。
[0050] 本发明的优点和有益效果:
[0051] 本发明首次发现了化R3基因表达与子宫肌瘤相关,通过检测受试者子宫组织中 化R3的表达,可W判断受试者是否患有子宫肌瘤、或者判断受试者是否存在患有子宫肌瘤 的风险,从而指导临床医师给受试者提供预防方案或者治疗方案。
[0052] 本发明发现了一种新的分子标记物-TLR3基因,相比传统的检测手段,基因诊断更 及时、更特异、更灵敏,能够实现子宫肌瘤的早期诊断。
【附图说明】
[0053] 图1显示利用QPCR检测TLR3基因在子宫组织中的表达情况;
[0化4] 图2显示利用Western blot检测TLR3蛋白在子宫组织中的表达情况;
[0055]图3显示利用QPCR在转录水平上检测TLR3基因的过表达情况;
[0化6] 图4显示利用Western blot检测TLR3蛋白的过表达情况。
[0057] 具体的实施方式
[0058] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。W下实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条 件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring化rborLaboratoiy Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0化9] 实施例1正常肌层组织和子宫肌瘤组织中TLR3基因的表达差异
[0060] 1、实验材料;
[0061] 无菌取因子宫肌瘤行全子宫切除术者的子宫肌瘤组织和邻近的正常肌层组织,患 者在术前3个月内未接受过激素治疗,术后均经病理确诊为子宫肌瘤,本实验材料取自5例 子宫肌瘤患者,患者年龄在25-45岁间。
[0062] 2、检测TLR3基因的差异表达
[0063] 2.1组织RNA的提取
[0064] 使用QIAGEN公司的RNAprep pure Tissue Kit(动物组织总RNA提取试剂盒 (DP431))按照操作说明提取。
[00化]2.2 RNA样品的质量分析(Nano化op 1000分光光度计)
[0066] NanoDroplOOO分光光度计检测RNA样品,RNA-seq测序的样品要求:0D260/0D280为 1.8-2.2。
[0067] 2.3 RNA样品的质量分析(Agilent Technologies SlOOBioanalyzer)
[006引 Agilent Technologies 2100Bioanalyze;r检测RNA样品质量,观察28S rRNA和18S rRNA主带明显、无降解、RNA完整性指数合格、浓度达到要求的符合RNA-seq测序cDNA文库构 建的要求,可W用于文库构建及测序。
[0069] 2.4高通量转录组测序
[0070] (l)RN
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