A-seq 读段定位
[0071] 首先将低质量的读段去除得到清洁读段，然后利用Top化t vl. 3.1将清洁片段与 UCSC H. sapiens参考基因组化gl9)进行匹配，H. sapiens UCSC hgl9版的预先构建的索引 从Top化t主页下载，并作为参考基因组，利用Top化t与基因组匹配时，允许每个读段(默认 到20)有多个匹配位点，最多2次错配。Top化t根据外显子区域和GT-AG剪切信号建立可能的 剪切位点库，根据运些剪切位点库将没有定位到基因组的读段定位到基因组上。我们使用 Top化t方法的系统默认参数。
[0072] (2)转录丰度评估
[0073] 匹配上的读段文件通过Cufflinks vl.0.3处理，Qifflinks vl.0.3将RNA-seq片 段数目进行标准化计算转录本的相对丰度。FPKM值指的是每一百万测序片段中匹配到特定 基因化b长的外显子区域的片段数目。通过贝叶斯推理方法计算FPKM估计值的置信区间。 Cufflinks使用的参考的GTF注释文件从Ensembl数据库下载（Homo_ sapiens.GRQi37.63.gtf)。
[0074] (3)差异表达基因的检测
[0075] 将下载的Ensembl GTF文件和通过TopHat匹配的原始文件传输到Cuffdiff， Cuffdiff使用原始的匹配文件重新估算GTF文件中列出的转录本的表达丰度，检测差异表 达。在化ffi壯f输出中只有q值<0.01，测试显示成功的比较才被认为是差异表达。
[0076] 3、结果
[0077] RNA-seq结果显示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中化R3基因的mRNA水平明 显降低，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0078] 实施例2差异表达基因的验证 [00巧]1、实验材料；
[0080]无菌取因子宫肌瘤行全子宫切除术者的子宫肌瘤组织和邻近的正常肌层组织，患 者在术前3个月内未接受过激素治疗，术后均经病理确诊为子宫肌瘤，本实验材料取自50例 子宫肌瘤患者，患者年龄在25-45岁间。
[0081 ] 2、检测TLR3基因的差异表达
[0082] 2.1组织RNA的提取
[0083] 使用QIAGEN公司的RNAprep pure Tissue Kit(动物组织总RNA提取试剂盒 (DP431))按照操作说明提取。
[0084] 2.2逆转录
[0085] 用逆转录缓冲液对bg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用25μ1反应体系，每个样品 取1 yg总RNA作为模板RNA，在PCR管中分别加入W下组分：DEPC水，5 X逆转录缓冲液， lOmmol/L dNTP，0.1mmol/l DTT，30ymmol/l Oligo (1Τ，20〇υ/μ1 M-MLV，模板RNAe42°C解育 化，72°C 1 Omin，短暂离屯、。
[0086] 2.3 QPCR
[0087] 采用实时巧光检测方法对mRNA丰度进行定量。如上述获得的cDNA在ABI Prism 7700序列检测器上进行扩增，TLR3基因引物、18S核糖体RNA基因引物设计如下：
[0088] TLR3 基因
[0089] 正向引物：5'-AAGCAATATGTTCACAGGATT-3'（沈Q ID N0.3);
[0090] 反向引物：5'-ATTCTTGGTTAGGTTGAGTATG-3'（沈Q ID N0.4)，
[0091] 18S rRNA
[0092] 正向引物：5'-AATCAGGGTTCGATTCCGGA-3'（沈Q ID N0.5);
[0093] 反向引物：5'-CCAAGATCCAACTACGAGCT-3'（沈Q ID N0.6)。
[0094] TLR3基因的表达使用18S核糖体RNA作内参。用12.5μ1的2倍量SYBR Green PCR master mix(包括扣mol/L的正向引物和扣mol/L反向引物)进行PCR，终体积为25μ1 JCR条 件为：95°C10min，50个循环(95°C30s，56°C30s，72°C30s)。使用ABIprism 7700型序列检测 仪对报告巧光染料所发射的巧光进行实时监测。巧光发射量反映循环数，并由序列检测仪 的软件读出，给出对PCR扩增有意义的循环数阔值，循环数的值与基因组DNA对数呈线性关 系。
[0095] 2.4统计学方法
[0096] 实验都是按照重复3次来完成的，结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示， 采用SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，不同组之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时 具有统计学意义。
[0097] 2.5 结果
[0098] 结果如图1所示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中化R3基因的mRNA水平显著 降低，差异具有统计学意义(P<〇. 05)。
[0099] 3、在蛋白水平上检测TLR3基因的差异表达
[0100] 3.1 步骤
[0101] (1)进行总蛋白的提取，按照化iQuik组织/细胞蛋白提取试剂盒的说明书进行蛋 白提取的操作。
[0102] (2)Weste;rn blot检测
[0103]总蛋白用化andford法定量，取适量与样品缓冲液混合煮沸5min，冷却5min;取 30pg蛋白上样到制备好的15%聚丙締酷胺凝胶，进行电泳，开始设为80V恒压，看见Marker 后增加至120V;将电泳后的胶取出，使用81〇.1?3(1半干转印系统于10(^转移5〇111111;转膜完毕 后，用IxPBS洗一次，浸入封闭液，40C过夜；倒掉封闭液，加入Western洗涂液洗涂5-lOmin， 加入一抗摇床室溫杂交化;按照适当比例用Western二抗稀释液稀释于封闭缓冲液中，解育 60min;洗膜液洗3次，每次lOmin;使用E化试剂显影、定影检测蛋白表达。
[0104] 3.2统计学处理
[0105] 将蛋白条带的灰度值使用Image J软件进行分析，Wi3-actin为内参，将目的白条 带的灰度值进行归一化处理。结果数据都是W平均值±标准差的方式来表示，采用 SPSS13.0统计软件来进行统计分析的，两者之间的差异采用t检验，认为当P<0.05时具有统 计学意义。
[0106] 3.3 结果
[0107] 结果如图2所示，与正常肌层组织相比，子宫肌瘤组织中化R3蛋白含量降低，差异 具有统计学意义(P<〇. 05)。
[010引实施例3 TLR3基因表达质粒构建
[0109] UTLR3基因表达载体的构建
[0110] 根据化R3基因的编码序列（如SEQ ID NO. 1所示）设计扩增引物。从成人胎脑的 cDNA文库klontech公司，货号:638831)中扩增全长的TLR3基因的编码序列，将上述cDNA序 列插入真核细胞表达载体PCDNA3.1中，连接获得的重组载体PCDNA3.1-TLR3用于后续实验。
[0111] 2、子宫肌瘤细胞的培养与转染
[0112] 手术切除子宫肌瘤后，立即在无菌条件下取子宫肌瘤组织1cm，置于lOmL 3%双抗 (青、链霉素）的PBS中，密闭冰浴尽快送入细胞培养室。子宫肌瘤组织用3%双抗的PBS液漂 洗，在含有DMM培养液的平皿中修剪成1mm;大小的组织块。将剪碎的组织小块用弯头吸管 送入培养瓶中，每小块间距2.0-3.0mm左右。组织块摆好后，将培养液吸出，轻轻将培养瓶翻 转，让瓶底朝上，向瓶内注入含15 %胎牛血清的DMEM培养液2mL，盖好瓶盖，将培养瓶倒置放 在37°