抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应用该抗体的免疫层析试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医学技术领域，设及抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体及应 用该抗体检测人肺炎链球菌的免疫层析试剂盒。
【背景技术】
[0002] 人肺炎链球菌（Sheptococcus pneumoniae，Sp)是儿童呼吸道感染的重要病原 体。主要经飞沫传播而进入呼吸道，从而寄生于人体的鼻咽部，或侵入人体不易清除的部位 引起一系列的疾病，如大叶性肺炎，脑膜炎，支气管炎，中耳炎等。它是全球所有年龄组高发 病率和病死率的主要病原菌。其中，在发展中国家，婴幼儿、老年人及免疫缺陷人群中尤为 严重。肺炎链球菌于1881年首次由己斯德化ouis化steur)及G.M.Sternberg分别在法国及 美国从患者疲液中分离出。其为革兰氏染色阳性，菌体似矛头状，成双或成短链状排列的双 球菌，有毒株菌体外有化学成分为多糖的芙膜。其芙膜具有抗原性，是肺炎链球菌分型的依 据。根据芙膜多糖抗原性的不同将肺炎球菌分为91个血清型。其菌体抗原主要为C多糖，其 存在于肺炎链球菌细胞壁中，具有种特异性，为各型菌株所共有。C多糖可被血清中C-反应 蛋白沉淀。在巧离子存在时，C多糖可与正常人血清中称为C-反应蛋白（C reactive protein，CRP)的防求蛋白结合，发生沉淀。目前针对人肺炎链球菌抗原的检测亦主要是针对 此抗原，而该抗原非肺炎链球菌独有，如缓和链球菌亦含有该抗原。并且C多糖的提纯过程 困难，造成生产成本较高。在肺炎链球菌表面还有一种与毒力相关的重要抗原，为肺炎链球 菌表面蛋白A(PspA)，其存在于所有肺炎链球菌血清型中，是肺炎链球菌的特异性抗原。 PspA分为3个家族，其中具有fami或fam2家族PspA蛋白的人肺炎链球菌占到了临床分离的 人肺炎链球菌种类的99 % W上。
[0003] 临床病人由于不同的呼吸道病原体(如肺炎支原体、流感嗜血杆菌、流感病毒、呼 吸道合胞病毒、腺病毒等)感染引起疾病症状可W十分相似，运导致了流行诊断比较困难， 确诊往往依赖于实验室诊断。快速有效的诊断方法应该是在疾病的发病初期就可W得到明 确的诊断，便于实施针对性的治疗，阻止病情的发展迁延。
[0004] 尽管肺炎链球菌在全球范围内传播，婴幼儿的感染尤其普遍，但可用于实验室诊 断的标准化商品试剂的种类极少。目前，肺炎链球菌的检测主要有W下几种方法：
[0005] -、常规实验室检测
[0006] 1、细菌分离
[0007] 实验室诊断肺炎链球菌的金标准是分离人肺炎链球菌毒株。采用鼻咽分泌物作为 病原体分离的标本，可W用血培养的方法分离病原体。但是该法有严重的缺陷，因为肺炎链 球菌是苛养菌，营养要求高，培养所需时间长，阳性率低，更重要的是，若采样前患者使用过 抗菌药物，会造成培养结果的假阳性。运样在临床方面对病人的治疗就有一定的局限性。 [000引 2、血清学检测
[0009]即采用酶联免疫法、放免法、微量免疫巧光法等，检测被检者血清中肺炎链球菌抗 体水平，可间接提示肺炎链球菌感染的存在。然而，血清学试验只能提供一种回顾性的诊 断，它需要同时检测患者急性期和恢复期的双份血清，如果恢复期中抗人肺炎链球菌抗体 效价比急性期高4倍或4倍W上才有诊断意义。另外，抗体出现的时机不易掌握，且因为菌体 血清型种类过多，导致其诱生的抗芙膜多糖抗体种类过多，对抗体的检测造成了很大的困 难，故现有血清学方法的检测质量受到一定限制。
[0010] 二、快速诊断
[0011] 直接检查人肺炎链球菌蛋白抗原和菌体核酸可达到快速诊断的目的，目前主要有 免疫巧光法、免疫酶法和PCR法等。免疫巧光法和免疫酶法均不能进行一步检测，均存在操 作步骤复杂，需要专业人员操作，检测时间长(2hW上），成本较高等缺点。PCR方法快速、灵 敏、特异，是目前研究肺炎链球菌感染的重要手段，但由于PCR对实验设备W及操作要求较 高，且易出现假阳性，在我国还不能作为常用的临床诊断方法。目前，检测人肺炎链球菌抗 原的方法主要为胶体金法检测其C多糖抗原，但是该法敏感度较低，对待检样品材料质量要 求较高，同时还存在与其他链球菌如缓和链球菌存在交叉反应等缺陷。PspA蛋白则是一个 极具特异性的检测标的。目前，关于抗人肺炎链球菌PspA蛋白抗体报道得最多的为相应的 多克隆抗体。多克隆抗体主要由基因工程表达的PspA蛋白免疫家兔等动物制备而成。其制 备方法简单，成本低，但是其具有特异性低、效价低、纯度低等缺陷。因此，低成本的制备高 特异性、高效价的抗人肺炎链球菌PspA蛋白抗体就显得十分重要。
【发明内容】
[0012] 针对【背景技术】中存在的运些技术问题，本发明的目的在于提供识别人肺炎链球菌 fam2家族PspA蛋白34-47位W及274-287位氨基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体 及应用该抗体的免疫层析试剂盒。
[OOU]抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体，其特征在于:所述抗人肺炎链球菌fam2 家族PspA蛋白抗体是分别识别人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位W及274-287位氨 基酸所组成的两个线性抗原表位的两种抗体，所述人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白在 GenBank序列号是WP_054380072.1;所述人肺炎链球菌f am2家族PspA蛋白34-47位的14个氨 基酸W及274-287位的14氨基酸的氨基酸序列分别为SPQW邸SSLEKKY及KLLD化DPEGKT孤； 将人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白34-47位的14个氨基酸W及274-287位的14氨基酸的序 列分别命名为F2P1及F2F2P2;所述抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体是AbF2Pl W及 AbF2P2。
[0014] -种基于如前所述的抗人肺炎链球菌fam2家族PspA蛋白抗体所形成的免疫层析 试剂盒，其特征在于:所述试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒或基于胶体金 标记技术的免疫层析试剂盒。
[0015]作为优选，本发明所提供的试剂盒是基于量子点标记技术的免疫层析试剂盒时， 所述试剂盒的制备方法是：
[0016] 1)量子点标记抗体AbF2Pl溶液：
[0017] 向微量离屯、管中依次加入0.4nmol簇基水溶性量子点和SOOnmol碳二亚胺抓C，W MES缓冲液定容为1ml，混合溶液，37°C反应5min后，再加入0.4mg的制备得到的抗体AbF2Pl， 避光反应化，加入单端氨基聚乙二醇阳G2000-NH2至终浓度为l%(m/v)，封闭未反应的活化 簇基位点，继续避光反应化；反应后的样品用超滤管离屯、（截留分子量100k)，6500g离屯、 5min，至体积200ul，将超滤后样品转移至普通EP管内，离屯、除团聚，得到上部清液W及下部 沉淀，lOOOOg条件下离屯、3min;将上部清液加到分离柱Superdex-200上纯化，待上部清液自 然流入柱体中，然后用PBS冲洗，用紫外光照射柱体观察样品的位置，待样品开始从下部流 出时开始收集，收集1ml后停止收集;将纯化后的样品用超滤管（截留分子量100k) W6500g 离屯、浓缩至200ul后转移至普通EP管内离屯、除团聚，对普通EP管进行离屯、的条件是lOOOOg， 3min;获取上清后W憐酸盐保存液稀释200倍，4°C保存备用；至此制得量子点标记抗体 AbF2Pl 溶液；
[0018] 所述MES缓冲液中各组分含量分别是：10.66g/L MESW及0.74g/L EDTA，所述MES 缓冲液的抑7.4;
[0019] 所述憐酸盐保存液的制备方式是称取0.29g憐酸氨二钢、0.0295g憐酸二氨钢、 0.2g氯化钢、Ig牛血清白蛋白BSA W及0.1 g化N3，溶解于90ml的去离子水中，用Imol/L NaOH 调pH至7.3后用去离子水定容至100ml;
[0020] 2)制备结合垫
[0021] 将聚醋纤维膜浸入步骤1)所得到的量子点标记抗体AbF2Pl溶液中化，取出，25°C 干燥后裁成后规格为4cm X 0.6cm/条后，4°C密封保存备用，至此制得结合垫；
[0022] 3)制备样品垫
[0023] 取玻璃纤维素膜一张，将玻璃纤维素膜在样品垫处理液中浸泡至少化，再置于生 物安全柜内37°C通风干燥后，剪裁成规格为4cmX2.5cm/条后，即制得样品垫，25°C密封保 存；
[0024] 所述样品垫处理液的制备方式是称取0.29g憐酸氨二钢、0.0295g憐酸二氨钢、 0.2g氯化钢、2g牛血清白蛋白BSA、1ml吐溫-20、2g薦糖W及0.5g聚乙締化咯烧酬PVP-10，溶 解于90ml的去离子水中，用Imol/L NaOH调抑至7.3后用去离子水定容至100ml;
[00巧]4)制备检测层
[0026] 将硝酸纤维素膜剪成4cm X 4cm大小；将制备得到的抗体AbF2P2和羊抗兔IgG用憐 酸盐缓冲液调整至终浓度分别为2.0mg/mL及1.〇111旨/1^;将稀释好的抗体AbF2P2装入BI0D0T 划膜仪喷头中，设置1.化1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上，形成检测线;将稀释好的抗兔IgG 装入BI0D0T划膜仪喷头中，设置1.化1/cm的量喷于硝酸纤维素膜上作为质控线，质控线与 检测线间距为0.7cm;将喷好的硝酸纤维素膜37°C干燥化，剪裁成4cmX4cm的规格，4°C密封 干燥保存;至此制得检测层；
[0027] 所述憐酸盐缓冲液的制备方式是:称取0.29g憐酸氨二钢、0.0295g憐酸二氨钢W 及0.2g氯