用于检测肺炎链球菌的引物和探针的制作方法

专利名称：：用于检测肺炎链球菌的引物和探针的制作方法
技术领域：
：本公开涉及用于检测肺炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae)的引物和探针，以及包含探针和引物的试剂盒，和使用探针和引物的方法。
背景技术：
：月市炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae(S.pneumoniae))是一种革兰氏阳性细菌，造成了相当高的发病率和死亡率(特别是在年轻人和老年人中)，引起疾病例如肺炎、菌血症、脑脊膜炎、急性中耳炎和鼻窦炎。据估计，20%的肺炎链球菌病例引起了菌血症，而其它表现例如脑脊膜炎，即使使用抗生素治疗，也有接近30%的死亡率。在11-76%的人群中，在鼻咽部发现有肺炎链球菌，儿童平均为40-50%，成年人平均为20-30%(Ghaffar等，J.Infect.Dis.18,638—46，1999)。最具肺炎球菌感染风险的人群是年龄在6个月到4岁之间的儿童，以及60岁以上的成年人。事实上，每个儿童在5岁之前都将经历肺炎球菌中耳炎。据估计，所有社区获得性肺炎中有25%是由于肺炎球菌(每100，000个居民中1，000人)。最近，疾病的流行已经在例如慢性病护理机构、军营和日间护理中心的环境中重新出现，这种情况自从抗生素前时代以来还没有被认识到。由于在幼儿、老年人和免疫受损患者中引起的发病率和死亡率，肺炎链球菌仍然是重要的人类病原菌。常规的肺炎链球菌诊断检验，受到培养的限制，难以建立明确的诊断。例如，从血液分离肺炎链球菌，这种公认的肺炎链球菌存在与否的确定性检验可能缺乏灵敏性，只在20-30%的肺炎球菌肺炎成年人病例中以及不到10%的儿童病例中给出阳性结果。用于抗体和抗原检测的血清学分析测试受困于缺乏特异性和灵敏性，例如最近引入的尿液抗原检验BinaxNOW,尽管通过一些研究显示出对于成年人是灵敏和特异的，但是在儿童中不能辨别携带和疾病。此外，将类似肺炎球菌的草绿色链球菌(P-LVS)错误鉴定成肺炎链球菌，为误诊提供了额外的机会，特别是在试图使用非无菌位点的样本例如痰液时。肺炎链球菌的鉴定一般是基于胆汁溶解性、奥普托欣(optochin)灵敏性以及GenProbeACCUPROBE肺炎球菌鉴定检验；但是已有不断增加的从临床样本中分离出P-LVS的报道，它们可能在一个或多个这些标准的肺炎球菌检验中给出阳性或可变的反应。在一部分报道的P-LVS分离株中，一个新鉴定的种，被分类为假肺炎链球菌(S.pseudopneumoniae(Spseudo)),已经被描述和表征(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42=4686-4696,2004)。假肺炎链球菌生物体胆汁溶解性阴性，在存在5%C02的情况下对奥普托欣有抗性，但是ACCUPROBE阳性(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42=4686-4696,2004)，因此产生了肺炎链球菌感染的假阳性。这些肺炎球菌类生物体的出现，使鉴定和诊断进一步复杂化，特别是使用非无菌位点的呼吸系统样本来确定时。因此，在临床背景下必须特别小心地监测和正确鉴定证实的肺炎球菌。因此，为了作出准确的诊断，存在着对能够辨别肺炎链球菌和假肺炎链球菌以及其它P-LVS物种的分析方法的需求。本公开内容通过提供能够区分肺炎链球菌和其它生物体、同时仍保留对肺炎链球菌的高度灵敏性的分析方法，满足了这种需求。
发明内容肺炎球菌疾病的准确诊断，通常受到将类似肺炎球菌的草绿色链球菌种(P-LVS)错误鉴定为肺炎链球菌(Str印tococcuspneumoniae(S.pneumoniae))的妨碍。为了实现准确诊断，分析方法应该对疾病的诊断、例如肺炎链球菌感染的诊断，既灵敏又高度特异。通过分析肺炎链球菌独特的lytA、ply和psaA基因区域，开发了本文公开的分析方法，它对肺炎链球菌高度特异，同时也对肺炎链球菌保持了高度灵敏性。因为公开的分析方法既灵敏又特异，因此可以可靠地确定非无菌样品、例如从对象获得的样品中肺炎链球菌的存在。这样的准确性对于医学专业人员作出最好的可能的诊断和治疗计划，是重要的，特别是在药物滥用、例如抗生素滥用的时代。此外，因为分析方法对于来自肺炎链球菌的核酸高度特异，与来自其它生物体的核酸没有显示出交叉反应，因此分析方法非常适合于多重分析，例如在多重实时PCR分析中，用于检测在样品、例如从对象获得的样品中存在的多种病原体。本公开涉及在样品中、例如在从对象获得的生物样品中，检测肺炎链球菌核酸的存在的方法，例如在样品中检测肺炎链球菌。公开的方法可用于在例如怀疑患有肺炎链球菌感染的对象中诊断肺炎链球菌感染，诊断是通过分析来自对象的生物样本，使用本文公开的探针和/或引物检测广泛的各种不同的肺炎链球菌核酸，例如肺炎链球菌lytA、ply和psaA核酸。此外，提供的探针和引物，允许通过快速确定感染是由肺炎链球菌还是另一种生物体引起的，来快速评估具有表观肺炎链球菌感染的对象。这种快速评估包括在例如多重实时PCR分析中排除肺炎链球菌的存在、判断肺炎链球菌的存在，或二者的组合。在某些实施方案中，方法包括将肺炎链球菌核酸与长度在20到40个核苷酸之间的肺炎链球菌特异性探针进行杂交，并检测肺炎链球菌核酸与探针之间的杂交。在某些实施方案中，探针被可检测地标记。在某些实施方案中，探针能够在非常高严紧性条件下，与显示在SEQIDN0:13(来自肺炎链球菌的lytA基因)、SEQIDNO14(来自肺炎链球菌的psaA基因)或SEQIDNO:15(来自肺炎链球菌的ply基因)中的肺炎链球菌核酸序列杂交。在具体实施方案中，探针包含与SEQIDN0:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO:9或SEQIDNO12中显示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。本公开还涉及检测和/或区分肺炎链球菌或另一种生物体、例如细菌生物体、例如类似肺炎链球菌的草绿色链球菌(P-LVS)、例如假肺炎链球菌(S.pseudopneumoniae(Spseudo))的方法。在某些实施方案中，本文公开的方法包括使用至少一个对肺炎链球菌核酸特异性的引物，来扩增肺炎链球菌核酸。在某些实施方案中，对肺炎链球菌核酸特异性的引物，长度为15到40个核苷酸，能够在非常高严紧性条件下，与SEQIDNO:13、SEQIDNO14或SEQIDNO:15中显示的肺炎链球菌核酸序列杂交。在某些实施方案中，对肺炎链球菌核酸特异性的引物，长度为15到40个核苷酸，包含有与SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:10或SEQIDNO11中显示的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。在某些实施方案中，使用至少一个、例如一对特异性针对肺炎链球菌基因、例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply基因的引物，来扩增肺炎链球菌核酸。在某些实施方案中，特异性针对肺炎链球菌lytA的引物，包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:4中的一个中显示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。在其它实施方案中，特异性针对肺炎链球菌psaA的引物，包含与SEQIDNO:7或SEQIDNO:8中的一个中显示的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列。在其它实施例中，特异性针对肺炎链球菌Ply的引物，包含与SEQIDNO10或SEQIDNO:11中的一个中显示的核酸序列具有至少95%同一性的核酸序列。本公开还涉及能够与肺炎链球菌核酸、例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply核酸杂交的探针。在某些实施方案中，这些探针的长度在20到40个核苷酸之间，能够在非常高严紧性条件下，与SEQIDNO:12、SEQIDNO13或SEQIDNO14中显示的肺炎链球菌核酸序列杂交。在几个实施例中，这些探针的长度在20到40个核苷酸之间，并包含在SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDNO12中显示的核酸序列。本公开还涉及能够与肺炎链球菌核酸、例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply核酸杂交并扩增它们的引物。在某些实施方案中，这些引物长度在20到40个核苷酸之间，能够在非常高严紧性条件下，与SEQIDN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO:15中显示的肺炎链球菌核酸序列杂交。在几个实施例中，这些引物的长度在15到40个核苷酸之间，并包含与SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDN0:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:11或SEQIDNO12中显示的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列。本公开还提供了用于在怀疑含有肺炎链球菌的样品中检测肺炎链球菌核酸的装置，例如阵列，以及试剂盒。本发明的上述的以及其它的目标、特征和优点，从下面的详细描述中，并参考随附的图，将变得更加显而易见。图1是用于肺炎链球菌特异性探针与肺炎链球菌核酸杂交的通用步骤的示意图。图2是用于肺炎链球菌特异性探针与肺炎链球菌核酸杂交的通用步骤的示意图，其中肺炎链球菌核酸在开始时是双链核酸。图3是使用肺炎链球菌特异性TAQMAN探针杂交和检测肺炎链球菌的通用步骤的示意图。图4是使用TAQMAN探针从实时聚合酶链反应(实时PCR)产生的理论数据的图。图5是在多重实时PCR分析中使用的肺炎链球菌特异性TAQMAN探针的图，显示了指示的探针和引物组的效率。序列表使用在37C.F.R.§1.822中定义的标准的核苷酸碱基三字母缩写和氨基酸单字母编码，显示了在随附的序列表中列出的核酸和氨基酸序列。如果对于每个核酸序列只显示一条链，对显示的链的任何指称应该被理解为包含了互补链。SEQIDNO1是理论寡聚物的核苷酸序列。SEQIDNO2是理论寡聚物的核苷酸序列。SEQIDNO3是肺炎链球菌lytA正向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO4是肺炎链球菌lytA反向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO5是肺炎链球菌lytA实时PCR探针的核苷酸序列。SEQIDNO6是肺炎链球菌lytA实时PCR探针的核苷酸序列。SEQIDNO7是肺炎链球菌psaA正向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO8是肺炎链球菌psaA反向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO9是肺炎链球菌psaA实时PCR探针的核苷酸序列。SEQIDNO10是肺炎链球菌ply正向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO11是肺炎链球菌ply反向实时PCR引物的核苷酸序列。SEQIDNO12是肺炎链球菌ply实时PCR探针的核苷酸序列。SEQIDNO13是肺炎链球菌lytA的示例性核苷酸序列。SEQIDNO14是肺炎链球菌psaA的示例性核苷酸序列。SEQIDNO15是肺炎链球菌ply的示例性核苷酸序列。发明详述I.术语的解释除非另有指明，技术术语都按照其常规用法使用。分子生物学常用术语的定义可以在BenjaminLewin的《基因VII》(GenesVII，由OxfordUniversityPress出版，1999)；Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(TheEncyclopediaofMolecularBiology,由BlackwellScienceLtd.出版，1994)；和RobertA.Meyers主编的《分子生物学与生物技术综合桌面参考〉〉(MolecularBiologyandBiotechnology:aComprehensiveDeskReference，由VCHPublishers,Inc.出版，1995)；以及其它类似参考书中发现。本文使用的不带两次的形式既指单数也指复数，除非上下文明确表明不是这样。例如，术语“探针”包括了单个和多个探针，可以被认为与词组“至少一个探针”等价。本文使用的术语“包含”是指“包括”。因此，“包含探针”意味着“包括探针”而不排除其它元件。此外，应该理解，所有对核酸或多肽给出的碱基大小或氨基酸大小，以及所有的分子量或分子质量值，都是近似值，用于描述目的而提供，除非特别指明。尽管可以使用与本文描述的相似或等价的许多方法和材料，但在下面描述了特别适合的方法和材料。在有冲突的情况下，以本发明的说明、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实施例仅仅是说明性的，不是限制性的。为了便于研究本发明的各种不同实施方案，提供了下列术语解释动物活的多细胞脊椎或无脊椎生物体，该类别包括例如哺乳动物和鸟类。术语哺乳动物包括人类和非人类哺乳动物。类似地，术语“对象”包括人类和兽医对象。扩增为了增加核酸分子的拷贝数。获得的扩增产物被称为“扩增子”。核酸分子(例如DNA或RNA分子)的扩增，是指使用技术增加样品中核酸分子的拷贝数，例如肺炎链球菌核酸、例如肺炎链球菌lyU核酸或其片段的拷贝数。扩增的一个例子是聚合酶链反8应(PCR)，其中将样品与一对寡核苷酸引物，在允许引物与样品中的核酸模板杂交的条件下相接触。引物在适合的条件下延伸，从模板解离，重新退火、延伸并解离，以扩增核酸的拷贝数。该循环可以重复。扩增的产物可以通过例如电泳、限制性内切酶裂解图、寡核苷酸杂交或连接，和/或核酸测序等技术来表征。其它的体外扩增技术的例子包括定量实时PCR，反转录酶PCR(RT-PCR)，实时PCR，实时反转录酶PCR(rtRT-PCR)，巢式PCR，链置换扩增(参见美国专利No.5，744，311)，无转录恒温扩增(参见美国专利No.6，033，881)，修复链反应扩增(参见W090/01069)，连接酶链反应扩增(参见欧洲专利公开EP-A-320308)，缺口填补连接酶链反应扩增(参见美国专利No.5，427，930)；偶联的连接酶检测和PCR(参见美国专利No.6，027，889)，以及NASBARNA无转录扩增(参见美国专利No.6，025，134)等。cDNA(互补性DNA)—段缺少内部非编码区段(内含子)和转录调控序列的DNA。cDNA也可以包含非翻译区(UTRs)，它们负责相应的RNA分子的翻译控制。cDNA可以在实验室中，通过反转录，从RNA、例如肺炎链球菌的RNA、例如编码肺炎链球菌lytA、psaA或ply的RNA合成。变化以某种方式变得不同，例如被改变，例如增加或降低。可检测的变化是可以检测到的变化，例如电磁信号的强度、频率或存在与否的变化，例如荧光，例如探针、例如特异性针对肺炎链球菌核酸、例如肺炎链球菌lyU核酸、肺炎链球菌psaA核酸或肺炎链球菌Ply核酸的TAQMAN探针的荧光的变化。在某些实施例中，可检测的变化是荧光强度的减小。在某些实施例中，可检测的变化是荧光强度的增加。互补的双链DNA或RNA链由碱基对的两条互补链构成。当一个核酸分子的碱基与另一个核酸分子的碱基形成氢键时，发生了互补性结合。一般来说，碱基腺嘌呤(A)与胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)互补，而胞嘧啶(C)与鸟嘌呤(G)互补。例如，一个ssDNA分子的序列5'-ATCG-3'可以与另一个ssDNA的3'-TAGC-5'成键，形成dsDNA。在该例子中，序列5‘-ATCG-3'与3'-TAGC-5‘反向互补。核酸分子甚至在每个分子的所有碱基没有完全形成氢键的情况下，也可以彼此互补。例如，与互补核酸序列的杂交可以在不同严紧性的条件下发生，其中互补链将在某些但不是所有的核苷酸位点处结合。在某些例子中，核酸分子，例如本文公开的特异性针对肺炎链球菌lytA、psaA或ply的探针和引物，与肺炎链球菌的lytA、psaA或ply核酸分子或这样的核酸分子的扩增产物互补。检测确定因子(例如信号、特定核苷酸、氨基酸、核酸分子和/或生物体)是否存在，例如肺炎链球菌是否存在。在某些例子中，这还可以包括定量。例如，在具体实施例中使用公开的探针，允许检测荧光团，例如检测来自荧光团的信号，它可用于确定是否存在对应于肺炎链球菌核酸(例如肺炎链球菌lyU核酸分子、肺炎链球菌psaA核酸分子或肺炎链球菌Ply核酸分子)的核酸。检测到肺炎链球菌核酸分子表明样品中存在肺炎链球菌，例如样品中存在肺炎链球菌感染。电磁辐照可以通过电场和磁场强度的同时周期性变化传播的一系列电磁波，包括无线电波、红外、可见光、紫外光、X-射线和、射线。在具体的例子中，电磁辐照由激光器发射，它可以具有单色性、定向性、相干性、偏振和强度的性质。激光器能够发射例如特定波长(或在相对狭窄波长范围内)的光，使得来自激光器的能量可以激发供体但不激发受9体荧光团。发射或发射信号从源产生的特定波长的光。在具体实施例中，发射信号在荧光团吸收了其激发波长处的光后，从荧光团发射。激发或激发信号必需和/或足以激发电子跃迁到较高能级的特定波长的光。在具体实施例中，激发是必需和/或足以将荧光团激发到某个状态的特定波长的光，使得荧光团发射出与激发信号的光的波长不同(例如更长)的波长的光。荧光团化学化合物，当通过暴露于特定刺激例如确定波长的光进行激发时，发射出例如不同波长的光(荧光)(例如波长更长的光)。荧光团是较大类别的发光化合物的一部分。发光化合物包括化学发光分子，它不需要特定波长的光来发光，而是使用化学能量源。因此，使用化学发光分子(例如水母素)，消除了对外部电磁辐照源、例如激光器的需要。可用于本文公开的肺炎链球菌特异性探针和引物的具体的荧光团的例子，对于本领域技术人员来说是已知的，包括在Nazarenko等的美国专利No.5，866，366中提供的，例如4-乙酰氨基-4'-异硫氰酸芪_2，2'二磺酸；吖啶及衍生物，例如吖啶和吖啶异硫氰酸酯，5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)，4-氨基-N-[3-乙烯基磺酰基)苯基]萘酰亚胺_3，5二磺酸酯(萤光黄VS)，N-(4-苯胺基-1-萘基)马来酰亚胺，2-氨基苯甲酰胺；亮黄；香豆素及衍生物，例如香豆素，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC，香豆素120)，7_氨基-4-三氟甲基香豆素(香豆素151)；四氯四溴荧光素(cyanosine)；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)；5'，5〃-二溴焦掊酚-磺酞(溴邻苯三酚红)；7_二乙基氨基-3-(4'-异硫氰酸基苯基)_4_甲基香豆素；二乙烯三胺五乙酸酯；4，4'-二异硫氰酸基二氢-芪_2，2'-二磺酸；4，4'-二异硫氰酸芪_2，2'-二磺酸；5-[二甲基氨基]萘-1-磺酰氯(DNS，丹磺酰氯)；4-二甲基氨基苯基偶氮苯基-4'-异硫氰酸酯(DABITC)；曙红及衍生物，例如曙红和曙红异硫氰酸酯；藻红及衍生物，例如藻红B和藻红异硫氰酸酯；溴化乙锭；荧光素及衍生物，例如5-羧基荧光素(FAM)、5-(4，6-二氯三嗪-2-基)氨基荧光素(DTAF)、2'7'-二甲氧基-4'5'-二氯_6_羧基荧光素(JOE)、荧光素、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、QFITC(XRITC)、-6-羧基-荧光素(HEX)和TET(四甲基荧光素)；荧光胺；IR144；IR1446；孔雀石绿异硫氰酸酯；4-甲基-伞形酮；邻甲酚酞；硝基酪氨酸；副玫瑰红(pararosaniline)；酚红；B_藻红蛋白；邻苯二甲醛；嵌二萘及衍生物，例如嵌二萘、嵌二萘丁酸酯和琥珀酰亚胺基1-嵌二萘丁酸酯；反应红4(CIBACR0N，亮红3B-A)；罗丹明及衍生物，例如6-羧基-X-罗丹明(R0X)、6-羧基罗丹明(R6G)、丽丝胺罗丹明B磺酰氯、罗丹明(Rhod)、罗丹明B、罗丹明123、罗丹明X异硫氰酸酯、N，N，N',N'-四甲基_6_羧基罗丹明(TAMRA)、四甲基罗丹明和四甲基罗丹明异硫氰酸酯(TRITC)；磺酰罗丹明B;磺酰罗丹明101和磺酰罗丹明101的磺酰氯衍生物(德克萨斯红)；核黄素；玫红酸和铽螯合物衍生物；LightCycler红640；Cy5.5以及Cy56_羧基荧光素；氟硼荧(borondipyrromethenedifluoride)(B0DIPY)；吖啶；芪；6-羧基-X-罗丹明(R0X)；德克萨斯红；Cy3；Cy5；VIC(AppliedBiosystems)；LC红640；LC红705；以及Yakima黄，等等。其它适合的荧光团包括本领域技术人员已知的，例如可以从MolecularProbes公司(Eugene，0R)获得的荧光团。在具体实施例中，荧光团被用作供体荧光团或受体荧光团。“受体荧光团”是吸收来自供体荧光团能量、例如大约400到900nm范围内(例如大约500到800nm范围内)的能量的荧光团。一般来说，受体荧光团吸收的光的波长通常比供体荧光团的最大吸收波长高至少lOnm(例如高至少20nm)，并在大约400到900nm波长范围内具有最大荧光发射。受体荧光团具有与供体荧光团的发射光谱重叠的激发光谱，使得供体发射的能量可以激发受体。理想情况下，受体荧光团能够连接到核酸分子上。在具体实施例中，受体荧光团是暗淬灭剂(darkquencher)，例如Dabcyl、QSY7(MolecularProbes)、QSY33(MolecularProbes)、BLACKHOLEQUENCHERS(GlenResearch)、ECLIPSEDarkQuencher(EpochBiosciences)或IOWABLACK(IntegratedDNATechnologies)0淬灭剂可以降低或淬灭供体荧光团的发射。在这样的例子中，不是检测当与供体荧光团足够接近时来自受体荧光团的发射信号的增加(或检测当与供体荧光团显著远时来自受体荧光团的发射信号的降低)，而是检测当淬灭剂距离供体荧光团显著远时来自供体荧光团的发射信号的增加(或当与淬灭剂受体荧光团足够近时来自供体荧光团的发射信号的降低)。“供体荧光团”是能够将能量传送到受体荧光团、从而从受体产生可检测的荧光信号的荧光团或发光分子。供体荧光团一般来说是吸收波长大约300到900nm，例如吸收波长大约350到800nm范围内的化合物。供体荧光团在所需激发波长处具有强的摩尔吸光系数，例如大于大约lOlicnT1。荧光共振能量转移(FRET)能量在相隔10-100人的最初被激发供体与受体分子之间传送的光谱学过程。供体分子一般在较短的波长处发射，该波长与受体分子的吸收波长重叠。能量转移的效率与供体与受体荧光团之间的距离(R)的负六次方(1/R6)成正比，发生时不发射光子。在使用FRET的应用中，供体和受体染料是不同的，在这种情况下，FRET可以通过受体的感应荧光的出现或通过供体荧光的淬灭来检测。例如，如果供体的荧光被淬灭，表明供体和受体分子在F6rster半径(FRET具有50%效率时的距离，大约为20-60A)范围内，而如果供体在其特征性波长处发射荧光，表明供体和受体之间的距离增加到了超过F6rster半径，例如在TAQMAN探针与靶核酸杂交后被Taq聚合酶降解时，或当发夹探针与靶核酸序列杂交时。在另一个例子中，能量通过FRET在不同的荧光团之间转移，使得受体分子可以在其特征性波长处发射光，该波长总是比供体分子的发射波长更长。使用FRET的可用于检测扩增子的寡核苷酸的例子包括线性寡聚探针例如HybProbes,5'核酸酶寡聚探针例如TAQMAN探针，发夹寡聚探针例如分子信标、蝎状引物和UniPrimers，小沟结合探针，以及自身发荧光扩增子例如发卡式引物(sunriseprimer)。杂交互补的单链DNA或RNA形成双链体分子(也被称为杂交复合物)的能力。核酸杂交技术可用于在探针或引物与核酸、例如肺炎链球菌核酸分子、例如肺炎链球菌lyU、psaA或ply核酸分子之间，形成杂交复合物。例如，与肺炎链球菌核酸分子具有一定同源性的探针或引物(例如SEQIDNOs3-12中的任一个)，将与肺炎链球菌核酸分子(例如SEQIDNOs13-15中任一个)形成杂交复合物。参考图1，杂交复合物110的形成，发生在单链探针105与单链靶核酸100(例如肺炎链球菌核酸分子，例如lytA、psaA或ply核酸分子)之间。参考图2，当靶核酸210最初是双链体核酸200的一条链时，必须将双链体解链(至少部分地)成靶核酸210和互补链220，用于探针205的杂交和形成杂交复合物230。导致特定严紧性程度的杂交条件，将根据杂交方法的性质以及杂交核酸序列的组成和长度而变化。一般来说，杂交温度和杂交缓冲液的离子强度(例如Na+浓度)将决定杂交的严紧性。关于获得特定严紧性程度的杂交条件的计算，讨论在Sambrook等，《分子克隆》(第二片反((1989)MolecularCloning,secondedition,ColdSpringHarborLaboratory,Plainview,NY)的第9和11章中。下面是一组示例性而不是限制性的杂交条件的例子非常高严紧性(检测具有至少90%同一性的序列)杂交:5xSSC，在65°C进行16小时清洗两次2xSSC,在室温(RT)进行，每次15分钟清洗两次0.5xSSC,在65°C进行，每次20分钟高严紧性(检测具有至少80%同一性的序列)杂交5x_6xSSC，在65°C_70°C进行16-20小时清洗两次2xSSC,在RT进行，每次5-20分钟清洗两次lxSSC，在55°C-70°C进行，每次30分钟低严紧性(检测具有至少50%同一性的序列)杂交6xSSC,在RT到55°C进行16-20小时清洗至少两次2x_3xSSC，在RT到55°C进行，每次20-30分钟。本文公开的探针和引物可以在低严紧性、高严紧性和非常高严紧性条件下，与肺炎链球菌核酸分子、例如lytA、psaA或ply核酸分子杂交。分离的“分离的”生物学成分(例如核酸)，已经与成分天然存在的其它的生物学成分，例如其它染色体和染色体外DNA、RNA和蛋白，基本上分离开或纯化出来。已经被“分离的”核酸包括通过标准纯化方法纯化的核酸。该术语还包括在宿主细胞中通过重组表达制备的核酸，以及化学合成的核酸，例如探针和引物，例如本文公开的肺炎链球菌特异性探针和引物。分离不要求绝对纯度，可以包括至少50%分离的，例如至少75%、80%、90%、95%、98%、99%或甚至100%分离的核酸分子。标记物能够例如通过光谱术、流式细胞术或显微术检测的试剂。例如，标记物可以连接于核苷酸，从而允许检测该核苷酸，例如检测该核苷酸是其一部分的核酸分子，例如肺炎链球菌特异性探针和/或引物。标记物的例子包括但不限于放射性同位素、酶的底物、辅因子、配体、化学发光试剂、荧光团、半抗原、酶及其组合。用于标记的方法以及选择适合于各种不同目的的标记物的准则，讨论在例如Sambrook等《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork,1989)禾口Ausubel等《分子生物学现代方法》(InCurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons，NewYork,1998)中。核酸(分子或序列)脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，包括但不限于cDNA、mRNA、基因组DNA和合成的(例如化学合成的)DNA或RNA。核酸可以是双链(ds)或单链(ss)的。当核酸是单链时，可以是正义链或反义链。核酸可以包括天然核苷酸(例如A、T/U、C和G)，可以包含天然核苷酸的类似物，例如标记的核苷酸。在某些实施例中，核酸是肺炎链球菌核酸，它可以包括从肺炎链球菌纯化的核酸，以及这样的核酸的扩增产物。核苷酸核酸分子的基本单元。核苷酸包括含氮碱基，它连接在戊糖单糖上，并具有1个、2个或3个通过酯键与糖基团连接的磷酸基团。DNA的绝大部分核苷酸是脱氧腺苷5'-三磷酸(dATP或A)、脱氧鸟苷5‘-三磷酸(dGTP或G)、脱氧胞苷5‘-三磷酸(dCTP或C)和脱氧胸苷5‘-三磷酸(dTTP或T)。RNA的绝大部分核苷酸是腺苷5'-三磷酸(ATP或A)、鸟苷5'-三磷酸(GTP或G)、胞苷5‘-三磷酸(CTP或C)和尿苷5‘-三磷酸(UTP或U)。核苷酸包括含有修饰的碱基、修饰的糖基团和修饰的磷酸骨架的核苷酸，例如在Nazarenko等的美国专利No.5，866，336中描述的(在此引为参考)。可用于在核苷酸结构上的任何位置修饰核苷酸的修饰的碱基部分的例子，包括但不限于5_氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-氯尿嘧啶，5-碘尿嘧啶，次黄嘌呤，黄嘌呤，乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿苷，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，0-D-半乳糖Q核苷(galactosylqueosine)，肌苷，N6_异戊烯基腺嘌呤，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲基氨基甲基尿嘧啶，甲氧基氨基甲基2-硫尿嘧啶，3-D-甘露糖Q核苷，5'-甲氧基羧甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲基硫代-N6-异戊烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸，假尿嘧啶，Q核苷，2-硫胞嘧啶，5-甲基-2-硫尿嘧啶，2-硫尿嘧啶，4-硫尿嘧啶，5-甲基尿嘧啶，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-S-氧基乙酸，5-甲基-2-硫尿嘧啶，3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶，以及2，6_二氨基嘌呤等等。可用于在核苷酸结构的任何位置上修饰核苷酸的修饰的糖基团的例子，包括但不限于阿拉伯糖，2-氟阿拉伯糖，木糖和己糖，或磷酸骨架的修饰成分，例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硫代氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、膦酸甲酯、烷基磷酸三酯或缩甲醛(formacetal)或其类似物。弓丨物短的核酸分子，例如DNA寡核苷酸，例如至少15个核苷酸的序列，可以通过核酸杂交与互补的靶核酸分子退火，在引物和靶核酸链之间形成杂交体。引物可以通过聚合酶沿着靶核酸分子延伸。因此，引物可用于扩增靶核酸分子(例如肺炎链球菌核酸分子的一部分，例如lytA、psaA或ply核酸分子的一部分)，其中引物的序列对于靶核酸分子是特异性的，因此例如引物将在非常高严紧性杂交条件下与靶核酸分子杂交。引物的特异性随着其长度增加。因此，例如，含有30个连续核苷酸的引物，将以与只有15个核苷酸的相应引物相比更高的特异性与靶序列退火。因此，为了获得更高的特异性，可以选择含有至少15、20、25、30、35、40、45、50个或以上连续核苷酸的探针和引物。在具体的实施例中，引物长度为至少15个核苷酸，例如与靶核酸分子互补的至少15个连续的核苷酸。可用于实施本公开的方法(例如用于扩增肺炎链球菌核酸分子的区域，例如lytA、psaA或ply核酸分子的一部分)的引物的具体长度，包括具有至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少45、至少50个或以上的、与待扩增的靶核酸分子互补的连续的核苷酸的引物，例如15-60个核苷酸、15-50个核苷酸、20-40个核苷酸、25-50个核苷酸或15-30个核苷酸的引物。可以例如通过PCR、实时PCR或其它本
技术领域：
已知的核酸扩增方法，使用引物对来扩增核酸序列。“上游”或“正向”引物是相对于核酸序列上的参比点5’方向的引物。“下游”或“反向”引物是相对于核酸序列上的参比点3’方向的引物。一般来说，在扩增反应中包含至少一个正向和一个反向引物。PCR引物对可以源自于已知序列(例如显示为SEQIDN0S:13-15的肺炎链球菌核酸序列)，例如通过使用用于此目的的计算机程序，例如Primer(0.5版，1991,WhiteheadlnstituteforBiomedicalResearch,Cambridge,MA)^PRIMEREXPRESS^^(AppliedBiosystems,AB,FosterCity，CA)。制备和使用引物的方法描述在例如Sambrook等《分子克隆实验指南》((1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarbor,NewYork)；Ausubel等《分子生物学现代方法》((1987)CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePubl.Assoc.&ffiley-Intersciences)中。在一个实施例中，引物包含标记物。探针探针包含能够与靶核酸(例如肺炎链球菌核酸，例如肺炎链球菌lyU、psaA或Ply核酸分子)杂交的分离的核酸。探针上可以连接可检测标记物或报告分子。典型的标记物包括放射性同位素、酶的底物、辅因子、配体、化学发光或荧光试剂、半抗原和酶。用于标记的方法和选择适合于各种不同目的的标记物的准则，讨论在Sambrook等《分子克隆实验指南》(MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress(1989))和Ausubel等《分子生物学现代方法》(CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssociatesandffiley-Intersciences(1987))中。在具体实施例中，探针包含至少一个荧光团，例如受体荧光团或供体荧光团。例如，荧光团可以连接到探针的5'-或3'-末端。在具体实施例中，荧光团连接到探针5’-末端的碱基上，其3’-末端的碱基上，其5’-末端的磷酸基团上或修饰的碱基上，例如探针内部的T。探针的长度一般为至少20个核苷酸，例如至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少26、至少27、至少28、至少29、至少30、至少31、至少32、至少33、至少34、至少35、至少36、至少37、至少38、至少39、至少40、至少41、至少42、至少43、至少44、至少45、至少46、至少47、至少48、至少49、至少50、至少51、至少52、至少53、至少54、至少55、至少56、至少57、至少58、至少59、至少60个或以上与靶核酸分子互补的连续的核苷酸，例如20-60个核苷酸、30-60个核苷酸、20-50个核苷酸、30-50个核苷酸、20-40个核苷酸或20-30个核苷酸。聚合试剂在化学反应中能够将单体分子(例如核苷酸)反应在一起，形成线性链或聚合物链的三维网络的化合物。聚合试剂的具体的例子是聚合酶，即催化与核酸模板互补的引物链的5’到3’延伸的酶。可用于扩增核酸分子的聚合酶的例子包括但不限于大肠杆菌DNA聚合酶I，特别是具有3’到5’核酸外切酶活性的Klenow片段，Taq聚合酶，反转录酶(例如HIV-1RT)，大肠杆菌RNA聚合酶，以及小麦胚芽RNA聚合酶II。聚合酶的选择依赖于待扩增的核酸。如果模板是单链DNA分子，可以使用DNA指导的DNA或RNA聚合酶；如果模板是单链RNA分子，那么可以使用反转录酶(例如RNA指导的DNA聚合酶)。定量核酸分子测定或测量存在的核酸分子的量(例如相对量)，例如样品中存在的扩增子的数量或核酸分子的数量。在具体实施例中，它是测定样品中存在的核酸分子、例如样品中存在的肺炎链球菌核酸分子的相对量或实际数量。荧光的淬灭荧光的降低。例如，当淬灭剂分子(例如上面列出的荧光淬灭剂)位于与荧光团足够接近的位置，使得它降低了荧光信号时(例如当探针含有荧光团和淬灭剂时，在探针与肺炎链球菌核酸序列结合之前)，发生了荧光团的荧光的淬灭。实时PCR:用于检测和测量在每个PCR循环过程中产生的产物的方法，产生的产物与开始PCR之前模板核酸的量成正比。获得的信息，例如扩增曲线，可用于确定靶核酸(例如肺炎链球菌核酸)的存在和/或定量靶核酸序列的起始量。实时PCR的示例性步骤可以在PerkinElmerAppliedBiosystems公司出版的“使用实时PCR检测定量DNA/RNA”("QuantitationofDNA/RNAUsingReal-TimePCRDetection，，，(1999))禾口《PCR方法》(PCRProtocols(AcademicPressNewYork,1989))中发现。在某些实施例中，被扩增的靶核酸(例如肺炎链球菌核酸分子，例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply核酸分子)的量，使用标记探针、例如用荧光团标记的探针、例如TAQMAN探针来检测。在该实施例中，在实时PCR过程中，实时测量荧光发射的增加。这种荧光发射的增加与靶核酸扩增(例如肺炎链球菌核酸)的增加直接相关。在某些实施例中，荧光的变化(dRn)使用方程dRn=Rn+-Rn_来计算，其中Rn+是在每个时间点时产物的荧光发射，RrT是基线荧光发射。将dRn值对循环数进行作图，得到了每个样品的扩增图，如图4中所示。参考图4，阈值(Ct)是荧光发射(dRn)超过选定阈值时的PCR循环数，一般为基线标准偏差的10倍(但是，如果需要，该阈值水平可以改变)。阈值循环是在对数_线性阶段中，系统开始检测到与PCR产物的指数增长相关的信号的增加的时间。该阶段提供了关于反应的信息。对数-线性阶段的斜率反映了扩增的效率。反应的效率可以通过下列方程计算E=10H/W)-1。PCR的效率应该为在每个循环扩增子90-100%的平均加倍。这相当于在Ct相对于对数-模板量标准曲线中斜率为-3.1到-3.6。为了获得准确的、可重复的结果，反应的效率应该尽可能接近100%(在每个循环扩增子平均增加2倍)。样品样品，例如生物学样品，是从动物或植物对象获得的样品。本文中使用的生物样品包括所有可用于在对象中检测肺炎链球菌感染的临床样品，包括但不限于细胞、组织和体液，例如血液；血液衍生物或级份，例如血清；提取的胆汁；活组织检查或手术取出的组织，包括例如未固定的、冷冻的、固定在福尔马林和/或包埋在石蜡中的组织；泪液；乳汁；皮屑；表面清洗液；尿液；痰液；脑脊液；前列腺液；脓；骨髓吸出物；中耳流出物，支气管肺泡灌洗物(levage)，气管吸出物，痰液，鼻咽吸出物，口咽吸出物或唾液。在具体实施方案中，生物学样品从动物对象获得，例如以中耳流出物、支气管肺泡灌洗物、气管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液的形式。序列同一性/相似性两个或多个核酸序列，或两个或多个氨基酸序列之间的同一性/相似性，根据序列之间的同一性或相似性来表示。序列同一性可以根据百分同一性来度量；百分率越高，序列越一致。当使用标准方法比对时，核酸或氨基酸序列的同源物或直系同源物，具有相对高水平的序列同一性/相似性。用于比对序列进行比较的方法在本
技术领域：
的众所周知的。各种不同的程序和比对算法描述在Smith&Waterman，Adv.Appl.Math.2:482，1981；Needleman&Wunsch，J.Mol.Biol.48:443,1970；Pearson&Lipm￡in，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85-.2444,1988；Higgins&Sharp，Gene，73:237_44，1988;Higgins&Sharp，CABIOS5:151-3，1989；Corpet等’Nuc.AcidsRes.1610881—90，1988；Huang等’ComputerAppls.intheBiosciences8，155-65，1992；以及Pearson等，Meth.Mol.Bio.24:307_31，1994中。Altschul等，J.Mol.Biol.215:403_10，1990，提出了对序列比对方法和同源性计算的详细^虑oNCBI的基本局部比对搜索工具(BasicLocalAlignmentSearchTool)(BLAST)(Altschul等，J.Mol.Biol.215=403-10,1990)可以从几个来源获得，包括国家生物信息中心(NationalCenterforBiologicallnformation(NCBI,NationalLibraryofMedicine,Building38A,Room8N805,Bethesda,MD20894))和互联网上，与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn禾口tblastx结合使用。Blastn用于比较核酸序列，而blastp用于比较氨基酸序列。其它信息可以在NCBI网站上找到。比对后，通过对两个序列中存在一致的核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行计数，确定匹配数。通过用匹配数除以在鉴定的序列中提出的序列长度，或除以明确指定的长度(例如来自在鉴定的序列中提出的序列的100个连续的核苷酸或氨基酸残基)，然后将得到的值乘以100，来确定百分序列同一性。例如，当核酸序列与具有1554个核苷酸的测试序列比对时，具有1166个匹配，则与测试序列的百分同一性是75.0(1166+1554*100=75.0)。百分序列同一性值被约到最接近的小数点后1位。例如，75.11,75.12,75.13和75.14被约到75.1，而75.15,75.16,75.17,75.18和75.19被约到75.2。长度值总是整数。在另一个例子中，含有20个核苷酸区域的靶序列与如下所示的来自被鉴定序列的20个连续的核苷酸进行比对，含有与该被鉴定序列具有75百分序列同一性的区域(即15+20*100=75)。120革巴序列atggtggacccggtgggctt(SEQIDN0:1)|||III||II被鉴定的序列acgggggatccggcgggcct(SEQIDNO:2)两个核酸分子密切相关的一个指示是两个分子彼此之间在严紧条件下杂交。严紧性条件是序列依赖性的，在不同环境参数下是不同的。本文公开的核酸探针和引物不限于显示的精确序列，正如本领域技术人员将会认识到的，如果需要，可以对序列进行改变，而不显著影响探针或引物发挥作用的能力。例如，在本文中提供了与SEQIDNOs3-12中的任一个具有至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%，例如100%序列同一性的序列。本领域技术人员将会认识到，这些提供的序列同一性范围仅仅是指导的目的；不在这些范围内的探针和引物可能也可以使用。信号提供了信息的物理性质的可检测的变化或脉冲。在本公开的方法的情况下，例子包括电磁信号，例如光，例如特定数量和波长的光。在某些实施例中，信号是物理事件的消失，例如光的淬灭。肺炎链球菌N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶(lytA):肺炎链球菌的lytA编码的自溶素。本文中使用的“lytA”是指lytA的核苷酸序列，因此例如在本文中公开的针对lytA的探针或引物，能够与lytA的核苷酸序列，例如下面给出的lytA核苷酸序列(或其互补体)杂交。示例的lytA核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登记16号AE005672，显示如下ttattttactgtaatcaagccatctggctctactgtgaattctggcttgtctgccagtgttccgtctggtttgaggtagtaccagcctgttccgtccgctgactggataaaggcatttgataccatggcgccttctttagcgtctaagtagtaccaagtgtccttgtacttgacccagcctgtcttcatggcaccttcttcgttgaaatagtaccacttatcagcgattttcttccagcctgtagccatttcgcctgagttgtcgaaccagtaccagttgccgtctgtgtgcttcctccagcggtctgcaagcatatagcctgaactgtcaaagtagtaccaagtgccattgattttctcaaacttgtcttttggataagagccgtctgaatgtacgtaccagtagccagtgtcattcttctgccagcctgtttcaatcgtcaagccgttctcaatatcatgcttaaactgctcacggctaatgccccatttagcaagatatggataagggtcaacgtggtctgagtggttgtttggttggttattcgtgcaatactcgtgcgttttaattccagctaaactccctgtatcaagcgttttcggcaaacctgcttcatctgctagattgcgtaagagttcgatataaaggcggtagtccgtcatgaactcttctttggttgaatggctttcaatcagttcaaccgctgcataggtctcagcattccaaccgcccccaacgtcccaggcaccattatcaacaggtcctacctgcatgatgcaaccgttcccaacaatgtgcgagaaaaaacctaattctgggtctttccgccagtgataatccgcttcattctgtacggttgaatgcggattcccagttgagtgtgcgtgtacttgcctatatggttgcacgccgacttgaggcaaatctgttcttaatttactcacattaatttccat(SEQIDNO13)0肺炎链球菌溶血素(ply)肺炎链球菌的毒力因子，是由4个结构域组成的硫醇活化的细胞溶素(TACYs)的一个成员。本文中使用的“ply”是指ply的核苷酸序列，因此例如在本文中公幵的针对ply的探针或引物，能够与ply的核苷酸序列，例如下面给出的ply核苷酸序列(或其互补体)杂交。示例的Ply核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登记号AE008539，显示如下ctagtcattttctaccttatcctctacctgaggatagagagttgttccccaaatagaaatcgtccgcttacgcactagtggcaaatcggttttttcataaaccgtacgccaccattcccaggcaagcccggtacactctctaattttgacagagagattacgaacattcccttttaaaggaatactagtggtaaagtgagccgtcaaatcctgcccatttctgtcccaagccttaggagtcaagacttccttaccttgatgatcataggataattcatcccaagtaatataatattgggcaacataggcaccactatgatccagcagtaaatctccgtttctgtaagctgtaaccttagtctcaacatagtctgtactgttttgaaaggtcgcaactacattgtcacgtaaaaaagaagttgtataggaaatcggcaagcctggatgatctgctgtaaagcgactgccttcttgaatcaagtcctctaccatatccaccttgcctgttacaactcgggcacccgaacttgggtcgccccctaaaataaccgccttcacttctgtattgtccaaaatctgcttccactctgtctgaggagctaccttgactccttttatcaaagcttcaaaagcagcctctacttcatcactcttactcgtggtttccaacttgagatagacttggcgcccataagcaacactcgaaatatagaccaaaggacgctctgcagaaattcctctctgttttaaatcctctaccgttacagtatcttgaaacacatctcctggatttttaacagcgtctacgctgactgtataataaatctgcttaaaattaacaatctgaatctgcttttcacctgaatggacagagttaaaatcaatatcaagagaattccctgtcttttcaaagtcagaaccaaacttgaccttgagttgttccatgctgtgagccgttattttttcatactgcattctagctgggacattattgacctgaccataatcttgatgccacttagccaacaaatcgtttaccgctccgcgaacacttgaattgctggggtcttccacttggagaaagctatcgctacttgccaaaccaggcaaatcaatactataagtcatcggagcacgatcaaccgcaagaagagtgggattattctctaacaaggtctcatccactacgagaagtgctccaggatagaggcgactgtcgttggtagctgttacagaaatatcacttgtatttgtcgacaagctccgcttctttctttcgataacaacaaactcatcgggtagctgattaccctctttgatgaaacgattttcaatactttctccctgatgggtcaagagtttctttttatcgtaattcatagctagtataaagtcatttactgctttatttgccat(SEQIDN0:14)o肺炎链球菌表面粘附素A前体(psaA):pSaA编码37_kDa的肺炎球菌脂蛋白，是ABCMn(II)转运复合体的一部分。本文中使用的“psaA”是指psaA的核苷酸序列，因此例如在本文中公开的针对psaA的探针或引物，能够与psaA的核苷酸序列，例如下面给出的psaA核苷酸序列(或其互补体)杂交。示例的psaA核苷酸序列，例如在2007年5月7日提交的GENBANK登记号U53509，显示如下tactgcttcagttttgggactctttattggctatagttttaatgttgcggcaggttctagtatcgtgcttacagctgctagtttctttctcattagcttctttatcgctcccaaacaacgatatttgaaactgaaaaataaacatttgttaaaataaggggcaaagccctaataaattggaggatctaatgaaaaaattaggtacattactcgttctctttctttctgcaatcattcttgtagcatgtgctagcggaaaaaaagatacaacttctggtcaaaaactaaaagttgttgctacaaactcaatcatcgctgatattactaaaaatattgctggtgacaaaattgaccttcatagtatcgttccgattgggcaagacccacacgaatacgaaccacttcctgaagacgttaagaaaacttctgaggctgatttgattttctataacggtatcaaccttgaaacaggtggcaatgcttggtttacaaaattggtagaaaatgccaagaaaactgaaaacaaagactacttcgcagtcagcgacggcgttgatgttatctaccttgaaggtcaaaatgaaaaaggaaaagaagacccacacgcttggcttaaccttgaaaacggtattatttttgctaaaaatatcgccaaacaattgagcgccaaagaccctaacaataaagaattctatgaaaaaaatctcaaagaatatactgataagttagacaaacttgataaagaaagtaaggataaatttaataagatccctgctgaaaagaaactcattgtaaccagcgaaggagcattcaaatacttctctaaagcctatggtgtcccaagtgcctacatctgggaaatcaatactgaagaagaaggaactcctgaacaaatcaagaccttggttgaaaaacttcgccaaacaaaagttccatcactctttgtagaatcaagtgtggatgaccgtccaatgaaaactgtttctcaagacacaaacatcccaatctacgcacaaatctttactgactctatcgcagaacaaggtaaagaaggcgacagctactacagcatgatgaaatacaaccttgacaagattgctgaaggattggcaaaataagcctctgaaaaacgtcattctcatgtgagctggcgttttttctatgcccacatttccggtcaaatcattggaaaattctgactgtttcagatacaatggaagaaaaaagattggagtatcctatggtaacttttctcggaaatcctgtgagctttacaggtaaacaactacaagtcggcgacaaggcgcttgatttttctcttactacaaca(SEQIDNO:15)。TAQMANPCR参考图3，选择了TAQMAN探针360与靶核酸330的一条链结合，该探针典型地含有报告分子320(例如短波长荧光团，例如6-羧基荧光素(FAM))和淬灭剂350(例如长波长的荧光团，例如BLACKHOLEQUENCHER1(BHQ1))。当辐照时，能量从报告分子320转移(通过FRET)到完整TAQMAN探针360的另一个末端上的淬灭剂350。因此，当TAQMAN探针360完整时，报告分子320与淬灭剂350的接近性阻止了任何信号的检测。当Taq聚合酶使用结合有TAQMAN探针360的引物300、301复制靶核酸330时，聚合酶380的5'外切核酸酶活性裂解了TAQMAN探针360。在降解后，FRET中断，结束了淬灭剂350的活性。报告分子320开始发射信号，该信号在每个循环中，与TAQMAN探针360裂解的速度成正比增加。PCR产物370的积累，通过监测报告分子320的信号的增加来检测。因为裂解只在TAQMAN探针360与靶核酸330杂交的情况下才发生，因此检测到的荧光的来源是特异性的扩增。杂交和裂解的过程不干扰PCR产物370的指数性积累。靶核酸分子打算对其进行检测、定量、定性检测或其组合的核酸分子。核酸分子不是必须处于纯化的形式。各种不同的其它核酸分子也可以与靶核酸分子共存。例如，靶核酸分子可以是意在对其进行扩增的特异性核酸分子(可以包括RNA例如肺炎链球菌RNA，或DNA例如肺炎链球菌DNA，例如肺炎链球菌lytA、psaA或plyDNA)。如果需要，靶核酸分子的纯化或分离可以通过本领域技术人员已知的方法来进行，例如使用可商购的纯化试剂18盒等。在一个例子中，靶核酸分子是肺炎链球菌核酸序列。II.几个实施方案的概述肺炎球菌疾病的准确诊断常常不仅受到从患者样本获得生物体分离株的困难性的阻碍，而且受到将类似肺炎球菌的草绿色链球菌种(P-LVS)错误地鉴定为肺炎链球菌的妨碍。为了获得准确的诊断，分析方法应该对疾病的诊断、例如肺炎链球菌感染的诊断既灵敏又高特异性。本文公开了被设计用于检测肺炎链球菌的探针和引物，它们可以在例如实时PCR分析，例如在多重实时PCR分析中，检测肺炎链球菌lytA、ply和psaA基因的特定序列区域。当在代表性的实时PCR分析中使用时，本文公开的探针和引物被证实对肺炎链球菌既高度灵敏又高度特异，代表了与典型的用于检测肺炎链球菌的探针和引物，例如由Corless等(Corless等，J.Clin.Microbiol.391553-1558，2001)和McAvin等(McAvin等，J.Clin.Microbiol.39=3446-3451,2001)描述的探针和引物相比，显著的进步。将本公开的探针和引物(lytA-CDC，psaA_CDC和ply-CDC)与Corless等和McAvin等描述的探针和引物(lytA-McAvin和ply-Corless)，在下列一组分离株中进行了直接比较(使用了实时PCR):67株肺炎链球菌(44个不同的血清型和3种来自结膜炎发作的无荚膜的肺炎链球菌)，以及104株非肺炎球菌分离株，结果证明，本文公开的探针和引物，例如特异性针对肺炎链球菌lytA、ply和psaA的探针和引物，在辨别肺炎链球菌分离株和非肺炎链球菌分离株方面更加优越。公开的探针，以及Corless等和McAvin等描述的探针，都能检测67株肺炎链球菌分离株。但是，公开的肺炎链球菌lytA和psaA特异性探针和引物，被证实对于肺炎链球菌具有比Corless等和McAvin等描述的分析方法更高的特异性。例如，Corless等和McAvin等描述的探针和引物记录了假阳性，在某些情况下可能导致肺炎链球菌的误诊。lytA-⑶C和psaA-⑶C实时PCR分析都是高特异性的，使用P-LVS分离株时没有显示出扩增。本文描述的新开发的方法，提供了比目前使用的分析方法具有更高的灵敏性和改进的特异性的分析测试。特异性的改进允许它们能够使用来自非无菌位点和无菌位点的样本，使得它们既适用于诊断又适用于携带研究中。lytA-⑶C和psaA-⑶C分析、特别是lytA-⑶C分析，代表了在特异性方面超过目前可用的分析方法的改进，因此应该被当作用于检测肺炎球菌DNA的分析方法的选择，特别是当临床样本中可能存在上呼吸道P-LVS时。使用本公开的探针和引物诊断肺炎链球菌，将导致误诊的减少，改进患者管理，并改进肺炎链球菌发作的监测。此外，正如实施例5证实的(参见图5)，本公开的探针和引物可以理想地用于多重PCR分析，用于同时检测多种不同病原体。本文公开的肺炎链球菌特异性探针和引物，例如lytA、psaA和ply特异性引物和探针，在使用用于检测其它呼吸道病原体的引物和探针的呼吸道多重平台中，提供了高的特异性。这种执行的多重化和速度的潜力，使得这些分析方法成为分子检测和流行病携带研究的有益工具。探针和引物公开了能够杂交并检测肺炎链球菌核酸分子、例如肺炎链球菌lytA核酸分子、肺炎链球菌psaA核酸分子或肺炎链球菌ply核酸分子的存在的探针。在某些实施方案中，这样的探针对于肺炎链球菌是特异性的，因此它们不与来自其它生物体、例如其它细菌的序列特异性杂交。公开的探针长度在20到40个核苷酸之间，例如长度为20、21、22、23、24、25、26、27、2829、30、31、32、32、34、35、36、37、38、39或40个核苷酸，并且能够与肺炎链球菌核酸分子杂交，例如显示为SEQIDNO:13的肺炎链球菌lytA序列、显示为SEQIDNO14的肺炎链球菌psaA序列，或显示为SEQIDNO15的肺炎链球菌ply序列。在几个实施方案中，探针能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDN013的肺炎链球菌核酸序列杂交。在其它实施方案中，探针能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDN0:14的肺炎链球菌核酸序列杂交。在其它实施方案中，探针能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌核酸分子杂交的探针，含有与显示为下列序列之一的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG(SEQIDNO5),TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG(SEQIDNO:6)，CTAGCACATGCTACAAGAATGATTGCAGAAAGAAA(SEQIDNO:9)，或CTCAAGTTGGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA(SEQIDN0:12)。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌lytA核酸分子杂交的探针，含有与显示为SEQIDNO:5或SEQIDNO:6的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌lytA核酸分子杂交的探针，基本上由显示为SEQIDNO:5或SEQIDNO6的核酸序列组成。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌psaA核酸分子杂交的探针，含有与显示为SEQIDNO:9的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌psaA核酸分子杂交的探针，基本上由显示为SEQIDNO9的核酸序列组成。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌ply核酸分子杂交的探针，含有与显示为SEQIDNO:12的核苷酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够与肺炎链球菌ply核酸分子杂交的探针，基本上由显示为SEQIDNO:12的核酸序列组成。在某些实施方案中，探针或者用同位素、或者用非同位素标记物可检测地标记，或者，将靶核酸(例如肺炎链球菌核酸分子，例如显示为例如SEQIDN0:13的肺炎链球菌lytA核酸分子或其子序列，显示为例如SEQIDNO14的肺炎链球菌psaA核酸分子或其子序列，或显示为例如SEQIDNO:15的肺炎链球菌ply核酸分子或其子序列)标记。非同位素标记物可以包括荧光或发光分子、生物素、酶或酶的底物或化学物质。优选选择这样的标记物，使得探针与靶核酸(例如肺炎链球菌核酸分子，例如肺炎链球菌lytA、肺炎链球菌psaA或肺炎链球菌ply核酸分子或其子序列)的杂交可以被检测。在某些实施方案中，探针用荧光团标记。适合的荧光团标记物的例子在上面给出了。在某些实施例中，荧光团是供体荧光团。在其它实施例中，荧光团是受体荧光团，例如荧光淬灭剂。在某些实施例中，探针包括供体荧光团和受体荧光团二者，例如供体荧光团例如FAM和受体荧光团例如BLACKHOLE淬灭剂。可以使用常规的方法选择适合的供体/受体荧光团对。在一个实施例中，供体发射波长可以显著激发受体，从而从受体产生可检测的发射。在某些实施例中，探针在3’-末端被修饰，以防止探针被聚合酶延伸。在具体实施例中，受体荧光团(例如荧光淬灭剂)被连接到探针的3’末端，供体荧光团被连接到探针的5’末端。在其它实施例中，受体荧光团(例如荧光淬灭剂)被连接20到探针的5’末端，供体荧光团被连接到探针的3’末端。在另一个具体实施例中，受体荧光团(例如荧光淬灭剂)被连接到修饰的核苷酸上(例如T)，供体荧光团被连接到探针的5’末端。公开了能够杂交并指导肺炎链球菌核酸分子的扩增的引物。在某些实施方案中，这样的引物对于肺炎链球菌是特异性的，因为它们不与来自其它生物体、例如其它细菌的核酸序列特异性杂交。本文公开的引物长度在15到40个核苷酸之间，例如长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或甚至40个核苷酸。在几个实施方案中，引物能够在非常高严紧性条件下与肺炎链球菌lyU核酸序列、例如显示为SEQIDN0:13的肺炎链球菌lyU序列杂交，并指导肺炎链球菌lyU核酸分子的扩增，例如SEQIDNO:13或其子序列的扩增。在几个实施方案中，引物能够在非常高严紧性条件下与肺炎链球菌psaA核酸序列、例如显示为SEQIDNO14的肺炎链球菌psaA序列杂交，并指导肺炎链球菌psaA核酸分子的扩增，例如SEQIDNO:14或其子序列的扩增。在几个实施方案中，引物能够在非常高严紧性条件下与肺炎链球菌ply核酸序列、例如显示为SEQIDNO:15的肺炎链球菌ply序列杂交，并指导肺炎链球菌ply核酸分子的扩增，例如SEQIDNO15或其子序列的扩增。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌核酸分子并指导其扩增的引物，含有与显示为下列序列的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列ACGCAATCTAGCAGATGAAGCA(SEQIDNO3),TCGTGCGTTTTAATTCCAGCT(SEQIDNO4),GCCCTAATAAATTGGAGGATCTAATGA(SEQIDNO:7)，GACCAGAAGTTGTATCTTTTTTTCCG(SEQIDNO:8)，GCTTATGGGCGCCAAGTCTA(SEQIDNO:10)或CAAAGCTTCAAAAGCAGCCTCTA(SEQIDNO:11)。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌核酸分子的引物，基本上由显示为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10或SEQIDNO11的核酸序列组成。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌lyU核酸分子并指导其扩增的引物，含有与显示为SEQIDNO:3或SEQIDNO:4的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌lyU核酸分子并指导其扩增的引物，基本上由显示为SEQIDN0:3或SEQIDNO:4的核酸序列组成。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌psaA核酸分子并指导其扩增的引物，含有与显示为SEQIDNO:7或SEQIDNO:8的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌psaA核酸分子并指导其扩增的引物，基本上由显示为SEQIDNO7或SEQIDNO8的核酸序列组成。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌Ply核酸分子并指导其扩增的引物，含有与显示为SEQIDN0:10或SEQIDNO:11的核酸序列至少95%同一，例如至少96%同一、至少97%同一、至少98%同一、至少99%同一或甚至100%同一的核酸序列。在几个实施方案中，能够杂交肺炎链球菌ply核酸分子并指导其扩增的引物，基本上由显示为SEQIDN0:10或SEQIDN0:11的核酸序列组成。在某些实施方案中，引物是引物组，例如引物对，能够杂交并扩增肺炎链球菌核酸分子，例如肺炎链球菌lytA、肺炎链球菌psaA或肺炎链球菌ply核酸分子。这样的引物组包含至少一个正向引物和至少一个反向引物，其中引物对于肺炎链球菌核酸分子，例如肺炎链球菌lytA、肺炎链球菌psaA或肺炎链球菌ply核酸分子的扩增是特异性的。在某些实施方案中，引物组包含至少一对引物，它们对于肺炎链球菌lytA、肺炎链球菌psaA或肺炎链球菌Ply核酸分子的扩增是特异性的，例如这样的引物组可以包括一对用于扩增肺炎链球菌lytA的引物，一对用于扩增肺炎链球菌psaA的引物，或一对用于扩增肺炎链球菌ply的引物，或其任何组合，例如一对用于扩增肺炎链球菌lytA的引物和一对用于扩增肺炎链球菌psaA的引物，一对用于扩增肺炎链球菌lytA的引物和一对用于扩增肺炎链球菌ply的引物，一对用于扩增肺炎链球菌ply的引物和一对用于扩增肺炎链球菌psaA的引物，或甚至一对用于扩增肺炎链球菌lytA的引物、一对用于扩增肺炎链球菌psaA的引物和一对用于扩增肺炎链球菌Ply的引物。在某些实施例中，引物组包含一对特异性用于肺炎链球菌核酸分子扩增的引物，该肺炎链球菌核酸分子包括肺炎链球菌lytA基因的核酸序列、例如显示为SEQIDNO13的核酸序列的一部分。在某些实施例中，引物对特异性用于扩增肺炎链球菌lytA核酸分子，并包含与SEQIDNO:3至少95%同一，例如与SEQIDNO:3至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及与SEQIDNO:4至少95%同一，例如与SEQIDNO:4至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。在某些实施例中，引物组包含一对特异性用于肺炎链球菌核酸分子扩增的引物，该肺炎链球菌核酸分子包括肺炎链球菌psaA基因的核酸序列、例如显示为SEQIDNO14的核酸序列的一部分。在某些实施例中，引物对特异性用于扩增肺炎链球菌psaA核酸分子，并包含与SEQIDN0:7至少95%同一，例如与SEQIDNO:7至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及与SEQIDNO:8至少95%同一，例如与SEQIDNO:8至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。在某些实施例中，引物组包含一对特异性用于肺炎链球菌核酸分子扩增的引物，该肺炎链球菌核酸分子包括肺炎链球菌ply基因的核酸序列、例如显示为SEQIDN0:14的核酸序列的一部分。在某些实施例中，引物对特异性用于扩增肺炎链球菌Ply核酸分子，并包含与SEQIDN0:10至少95%同一，例如与SEQIDNO:10至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的正向引物，以及与SEQIDNO:11至少95%同一，例如与SEQIDNO11至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或甚至100%同一的反向引物。尽管在SEQIDN0S:3_12中提供了示例性探针和引物，但引物和/或探针序列可以通过将探针从它们在肺炎链球菌核酸分子上杂交的核苷酸位置向上游或下游移动几个核苷酸，来轻微地改变，只要探针和/或引物仍然对肺炎链球菌核酸序列特异，例如对SEQIDNO13,SEQIDN0:14或SEQIDN0:15特异。例如，公开为SEQIDNOs:3_12的探针和引物的改变，可以通过将探针和/或引物从它们的位置向5’或3’方向“滑动”几个核苷酸来进行，这样的变化将仍然对肺炎链球菌lytA、psaA或ply特异。本申请还提供了包含有对SEQIDNOs:3-12任一个中显示的核苷酸序列作出了改变的探针和引物，只要这样的改变仍然允许检测肺炎链球菌核酸分子。例如，探针或引物可以与由SEQIDNOs:3-12任一个中显示的序列组成的核酸具有至少95%的序列同一性，例如至少96%、至少97%、至少98%、至少99%的序列同一性。在这样的实施例中，核苷酸的数量没有变化，但是在SEQIDNOs:3-12任一个中显示的核酸序列可能改变几个核苷酸，例如改变1、2、3或4个核苷酸。本申请还提供了比SEQIDNOs:3-12任一个中显示的核苷酸序列略长或略短的探针和引物，只要这样的删除或添加仍然允许检测目标肺炎链球菌核酸分子，例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply序列。例如，探针可以在SEQIDNOs:3_12任一个中显示的探针或引物的5’-或3’-末端包含几个核苷酸的缺失或添加，例如从5’-或3’-末端添加或缺失1、2、3或4个核苷酸，或其组合(例如从一个末端缺失，在另一个末端添加)。在这样的实施例中，核苷酸数量改变了。肺炎链球菌的检测本文公开的肺炎链球菌特异性引物和探针的主要应用，是用于检测样品中的肺炎链球菌，例如从具有或怀疑具有肺炎链球菌感染的对象获得的生物学样品检测肺炎链球菌。因此，公开的方法可以用于诊断对象是否具有肺炎链球菌。因此，公开了用于检测肺炎链球菌核酸的方法，以便例如确定对象是否感染有肺炎链球菌。本文描述的方法可用于任何需要检测肺炎链球菌的目的，包括诊断和预后应用，例如在实验室和临床环境中。适合的样品包括任何常规的环境或生物学样品，包括从人类或兽医对象获得的临床样品。适合的样品包括所有可用于在对象中检测细菌感染的生物样品，包括但不限于细胞，组织(例如肺、肝和肾)，骨髓吸出物，体液(例如血液、血清、尿液、脑脊液、支气管肺泡灌洗物、气管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物、唾液)，眼部拭子，子宫颈拭子，阴道拭子，直肠拭子，粪便和粪便悬浮液。其它适合的样品包括从中耳流出物、支气管肺泡灌洗物、气管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液获得的样品。用于获得这样的样品的标准技术是可获得的。参见例如3油1呢吐等，丄即』6(1.176:1327-33(1992)；Bigby等，Am.Rev.Respir.Dis.133:515_18(1986)；Kovacs等，NEJM318589-93(1988)；以及Ognibene等，Am.Rev.Respir.Dis.129:929_32(1984)。检测样品中的肺炎链球菌核酸，包括将样品与至少一个本文公开的、能够在非常高严紧性条件下与肺炎链球菌核酸、例如肺炎链球菌lyU核酸、肺炎链球菌psaA核酸或肺炎链球菌Ply核酸杂交的肺炎链球菌特异性探针(例如能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交的核酸探针，例如与显示为SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDNO12之一的核苷酸序列至少95%同一的核酸序列，例如基本上由显示为SEQIDNO:5、SEQIDNO:6、SEQIDNO9或SEQIDN012之一的核酸序列组成的核酸序列)相接触，并检测肺炎链球菌核酸与探针之间的杂交。探针与肺炎链球菌核酸之间的杂交的检测，指示了样品中肺炎链球菌核酸的存在，例如肺炎链球菌lyU探针和肺炎链球菌lyU核酸之间的杂交的检测，指示了样品中肺炎链球菌核酸的存在，肺炎链球菌psaA探针和肺炎链球菌psaA核酸之间的杂交的检测，指示了样品中肺炎链球菌核酸的存在，肺炎链球菌ply探针和肺炎链球菌ply核酸之间的杂交的检测，指示了样品中肺炎链球菌核酸的存在。在某些实施方案中，样品中存在的肺炎链球菌核酸，在使用杂交探针进行检测前，被扩增。例如，扩增肺炎链球菌核酸的一部分，然后检测被扩增的肺炎链球菌核酸的存在，可能是有利的。例如，为了增加可以被检测的核酸的数量，从而增加获得的信号。肺炎链球菌特异性核酸引物可以用于扩增长度为至少大约50、至少大约60、至少大约70、至少大约80、至少大约90、至少大约100、至少大约200或以上碱基对的区域，产生扩增的肺炎链球菌特异性核酸。扩增产物的检测典型情况下包括使用与被扩增的肺炎链球菌核酸序列足够互补并与其杂交的标记的探针。因此，可以通过与扩增产物互补的标记的探针、例如荧光标记的探针的杂交，来检测扩增产物的存在、量和/或身份。在一个实施方案中，目标靶核酸序列、例如肺炎链球菌lytA核酸、肺炎链球菌psaA核酸或肺炎链球菌ply核酸的检测，包括组合地使用PCR扩增和标记探针，以便使用实时PCR测量产物。在另一个实施方案中，扩增的目标靶核酸序列的检测，包括将扩增的靶核酸转移到固相支持物、例如印迹、例如Northern印迹上，并用与扩增的靶核酸序列互补的探针、例如标记的探针探测印迹。在另一个实施方案中，扩增的目标靶核酸序列的检测，包括将标记的扩增靶核酸，排列在具有可寻址位置的预定的阵列中、并且与扩增的靶核酸互补的本文公开的探针进行杂交。可以使用任何核酸扩增方法来检测样品中肺炎链球菌的存在。在一个具体的非限制性的实施例中，使用了聚合酶链反应(PCR)扩增肺炎链球菌核酸序列。在其它具体的、非限制性实施方案中，使用了实时PCR、反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时反转录酶-聚合酶链反应(rtRT-PCR)、连接酶链反应或转录介导的扩增(TMA)来扩增肺炎链球菌核酸。在具体的实施例中，肺炎链球菌lytA核酸通过实时PCR、例如实时TAQMANPCR扩增。用于核酸扩增的技术对于本领域技术人员来说是熟知的。典型情况下，在扩增反应中使用至少两个引物，肺炎链球菌核酸的扩增，包括将肺炎链球菌核酸，与能够杂交并指导肺炎链球菌的扩增的一个或多个引物(例如能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQN0:13、SEQIDN0:14或SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交的引物，例如与显示为SEQIDN0:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO:7、SEQIDNO:8、SEQIDNO:10或SEQIDNO:11之一的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物)相接触。在某些实施方案中，将样品与包含正向和反向引物的一对引物相接触，两个引物都与肺炎链球菌lytA核酸杂交，例如与显示为SEQIDN03的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和与显示为SEQIDNO:4的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。在某些实施方案中，将样品与包含正向和反向引物的一对引物相接触，两个引物都与肺炎链球菌psaA核酸杂交，例如与显示为SEQIDN07的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和与显示为SEQIDNO:8的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。在某些实施方案中，将样品与包含正向和反向引物的一对引物相接触，两个引物都与肺炎链球菌ply核酸杂交，例如与显示为SEQIDN0:10的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物，和与显示为SEQIDNO:11的核苷酸序列至少95%同一(例如100%同一)的引物。扩增的肺炎链球菌核酸，可以被实时检测，例如通过实时PCR，以便确定样品中肺炎链球菌特异性核酸、例如肺炎链球菌lytA、psaA或ply核酸的存在和/或量。通过这种方式，可以使用特异性针对从目标肺炎链球菌序列扩增的产物、例如扩增的肺炎链球菌lytA、24psaA或ply核酸序列的探针，来检测扩增的核酸序列，例如扩增的肺炎链球菌lytA、pSaA或ply核酸序列。实时PCR监测反应过程中发射的荧光，作为每个PCR循环过程中扩增子的产生的指示，而不是终点检测。在某些系统中，反应的实时进程可以被可视化。典型情况下，实时PCR使用荧光报告分子的检测。典型情况下，荧光报告分子的信号与反应中PCR产物的量成正比增加。通过记录每个循环的荧光发射量，有可能监测在指数期过程中的PCR反应，此时PCR产物量的显著增加第一次与靶模板的起始量相关。核酸靶的起始拷贝数越高，观察到荧光的显著增加越早。在一个实施方案中，荧光标记的探针利用荧光共振能量转移(FRET)、或者样品的荧光发射波长的变化，作为实时检测DNA探针与扩增的靶核酸的杂交的方法。例如，在不同探针上的产荧光标记物(例如使用HybProbes)之间、或相同探针上荧光团和非荧光淬灭剂(例如使用分子信标或TAQMAN探针)之间发生的FRET，可以鉴定与目标DNA序列特异性杂交的探针，通过这种方式，使用肺炎链球菌lytA探针、肺炎链球菌psaA探针、肺炎链球菌Ply探针，可以检测样品中肺炎链球菌的存在和/或量。在某些实施方案中，用于鉴定扩增产物的荧光标记DNA探针具有光谱独特的发射波长，使得可以在同样的反应管中、例如在多重PCR、例如多重实时PCR中，将它们区分开。在某些实施方案中，本文公开的探针和引物被用于多重实时PCR。例如，多重PCR允许使用公开的探针同时检测lytA、pSaA和ply核酸，或甚至其它核酸、例如对照核酸、例如RNAseP核酸的扩增产物。使用公开的引物和探针，可以检测lytA、psaA和ply的任何组合。在另一个实施方案中，在扩增步骤后，可以进行扩增的靶核酸的熔解(解链)曲线分析。核酸序列的Tm依赖于序列的长度及其G/C含量。因此，鉴定核酸序列的1可用于鉴定扩增的核酸，例如通过使用双链DNA结合染料化学方法，这种方法通过使用非序列特异性荧光嵌入剂(例如SYBR绿或溴化乙锭)来定量扩增子的产生。SYBR绿是一种产荧光的小沟结合染料，在溶液中几乎不显示荧光，但是在与双链DNA结合后发射强烈的荧光信号。典型情况下，SYBR绿用于单式反应，但是在与熔点分析结合时，可用于多重反应。可以使用任何类型的热循环仪装置，进行肺炎链球菌核酸、例如lytA、psaA或ply核酸的扩增和/或杂交的测定。适合的装置的例子包括PTC-100Peltier热循环仪(MJResearch,Inc.；SanFrancisco,CA)，ROBOCYCLER40温度循环仪(Stratagene；LaJolla,CA),^GENEAMPPCR%^t9700(AppliedBiosystems；FosterCity,CA)。对于实时PCR来说，可以使用任何类型的实时热循环仪装置。例如，BioRadiCycleriQTM,LIGHTCYCLER(Roche；Mannheim,Germany),7700序列检测器(PerkinElmer/AppliedBiosystems；FosterCity,CA)，ABI系统例如7000,7500,7700或7900系统(AppliedBiosystems；FosterCity,CA)，或MX4000、MX3000或MX3005(Stratagene；LaJolla,CA),DNAEngineOpticon连续荧光检测系统(MJResearch)，以及C印heidSMARTCYCLER，可以用于实时扩增核酸序列。在某些实施方案中，检测样品中肺炎链球菌核酸序列的存在，包括提取肺炎链球菌DNA。DNA提取涉及将DNA从细胞或样品中的潜伏或不可接近的形式中释放出来，并使DNA变得可以自由使用。在这样的状态下，它适合于肺炎链球菌核酸的有效检测和/或扩增。释放DNA可以包括实现细胞破碎的步骤。此外，DNA的提取可以包括获得溶解在水性介质中，25与其它细胞成分至少部分分离的DNA的步骤，其中这些其它细胞成分可以是颗粒状的或溶解的。在某些实施方案中，检测样品中肺炎链球菌lytA核酸序列的存在，包括提取肺炎链球菌RNA。RNA提取涉及将RNA从细胞或样品中的潜伏或不可接近的形式中释放出来，并使RNA变得可以自由使用。在这样的状态下，它适合于肺炎链球菌核酸的有效检测和/或扩增。释放RNA可以包括实现细胞破碎的步骤。RNA的提取一般在有效排除或抑制可能存在的任何核酸酶活性的条件下进行。此外，RNA的提取可以包括获得溶解在水性介质中，与其它细胞成分至少部分分离的RNA的步骤，其中这些其它细胞成分可以是颗粒状的或溶解的。本领域技术人员将会了解适合于从样品中提取核酸例如RNA和/或DNA的方法；这样的方法将依赖于例如在其中发现肺炎链球菌核酸的样品的类型。例如，核酸可以使用异硫氰酸胍提取，例如Chomczynski等的通过酸性异硫氰酸胍-苯酚-氯仿抽提的一步分离方法(Anal.Biochem.162156-59，1987)。样品可以直接使用，或者可以被处理，例如通过加入溶剂、防腐剂、缓冲液或其它化合物或物质。核酸可以使用标准方法来提取。例如，核酸的快速制备可以使用可商购试剂盒来进行(例如QIAGENDNA小型试剂盒(QIAGEN)，RocheMagNA纯化紧凑型核酸分离试剂盒I或RNEASY小型试剂盒(QIAGEN)；NUCLISENSNASBA诊断试剂(bioM6rieux)；或MASTERPURE全DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE))。在某些实施方案中，探针用同位素或非同位素标记物可检测地标记；在可选实施方案中，将肺炎链球菌核酸标记。非同位素标记物可以例如包括荧光或发光分子，或者酶、辅因子、酶的底物或半抗原。将探针与RNA、DNA的单链或双链制备物、或二者的混合物温育，然后测定杂交。在某些实施例中，杂交导致了信号的可检测的变化，例如来自标记探针的信号的增加或降低。因此，检测杂交，包括在杂交期间或之后，检测来自标记探针的信号相对于杂交之前来自标记物的信号的变化。肺炎链球菌鉴定阵列公开了含有用于检测肺炎链球菌的多种异源探针的阵列。这样的阵列可用于快速检测样品中的肺炎链球菌。阵列是基质上可寻址的位置的排列，每个地址含有核酸，例如探针，例如本文公开的肺炎链球菌lytA、psaA或ply探针。在某些实施方案中，每个地址对应于单一类型或类别的核酸，例如单个探针，尽管具体的核酸可以多次包含在多个地址上。“微阵列”是用于检测杂交的小型化的、需要显微镜观察的阵列。较大的“微阵列”允许每个地址可以被人类裸眼识别，在某些实施方案中，杂交信号不需要另外放大就可检测。地址可以是标记的、适合于独立的引导物，或可以通过位置识别。在某些实施方案中，肺炎链球菌检测阵列是阵列地址上的独立探针的集合。然后将肺炎链球菌检测阵列与怀疑含有肺炎链球菌核酸的样品，在允许探针与样品中的核酸之间发生杂交的条件下相接触。可以使用任何潜在地含有、或甚至怀疑含有肺炎链球菌核酸的样品，包括核酸提取物，例如扩增的或未扩增的DNA或RNA制备物。来自阵列上单个地址的杂交信号，指示了探针与样品中的核苷酸的杂交。该系统允许同时通过多个探针分析样品，并产生识别了样品中包含的肺炎链球菌核酸的信息。在可选实施方案中，阵列含有肺炎26链球菌核酸，阵列与含有探针的样品接触。在任何这样的实施方案中，探针或肺炎链球菌核酸任何一个都可以被标记，以便于杂交的检测。核酸可以干燥或液体形式加到阵列基质上。其它化合物或物质也可以添加到阵列上，例如缓冲液、稳定剂、用于检测杂交信号的试剂、乳化剂或防腐剂。在某些实施例中，阵列包括在阵列上存在多次(两次或以上)的一种或多种分子或样品，用于为阵列提供附加的特征，例如多余的活性或提供内部对照。在阵列中，每个排列的核酸是可寻址的，使得其位置可以在阵列表面的至少两个维度中被可靠地、一致地确定。因此，定制的阵列允许在将每个核酸放置在阵列中时指派它的位置。通常情况下，提供了阵列图或索引，以将每个地址与适当的核酸相关联。定制的阵列通过以对称的格网样式排列，但是核酸可以其它的样式排列(例如以径向分布的线，“轮辐和轮”样式或定制的簇的样式)。可寻址的阵列可以是计算机可读的；计算机可以被编程，以便将阵列上的具体地址与关于该位置上的样品的信息相关联，例如杂交或结合数据，包括信号强度。在某些示例性计算机可读格式中，阵列中的个体样品或分子有规律地排列(例如以笛卡尔格网样式)，可以由计算机与地址信息相关联。阵列中的地址可以具有任何适合的形状和尺寸。在某些实施方案中，核酸悬浮在液体介质中，包含在阵列基质上的正方形或长方形孔中。但是，核酸也可以包含在基本上三角形、椭圆形、圆形或不规则的区域中。阵列本身的总体形状也可以变化，尽管在某些实施方案中，它基本上是平的，形状为长方形或正方形。肺炎链球菌检测阵列在结构、组成和目的功能性方面可以不同，可以基于宏阵列(macroarray)或微阵列格式，或其组合。这样的阵列可以包括例如至少10个、至少25个、至少50个、至少100个或以上的地址，通常在每个地址上具有单一类型的核酸。在宏阵列的情况下，通常不需要尖端复杂的设备来检测阵列上的杂交信号，尽管可以通过标准的扫描和/或定量技术和设备来帮助定量。因此，本文描述的宏阵列分析可以在大多数医院、农业和医学研究实验室、大学或其它机构中进行，而不需要投资专门的、昂贵的读取设备。用于本文公开的阵列的基质的例子包括玻璃(例如功能化的玻璃)、Si、Ge、GaAs、GaP、Si02、SiN4、改性的硅硝酸纤维素、聚偏二氟乙烯、聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚碳酸酯、尼龙、纤维或其组合。阵列基质可以是刚性和相对不易弯曲的(例如玻璃或支持膜)，或者是挠性的(例如聚合物膜)。一种适合于本文描述的探针阵列的可商购的产品系列是可以从DynexTechnologiesUK(Middlesex，英国)获得的MICROTITER板的Microlite系列，例如Microlite1+96孔板，或384Microlite+384孔板。阵列上的地址应该是分离的，因为来自每个地址的杂交信号，可以通过裸眼(宏阵列)或通过一件设备的扫描或读取或在显微镜的帮助下(微阵列)，与来自邻近地址的信号区分开。阵列中的地址可以具有相对大的尺寸，例如大的足以允许不需要显微镜或其它设备的帮助就可以检测杂交信号。因此，地址可以小至大约0.1mm的跨度，并隔开大约相同的距离。或者，地址可以为大约0.5、1、2、3、5、7或10!11111的跨度，并隔开相似的或不同的距离。在某些实施方案中使用较大的地址(大于10mm的跨度)。阵列的总尺寸一般与地址的尺寸相关联(例如，较大的地址通常可以在较大的阵列上发现，而较小的地址可以在较小的阵列上发现)。但是，这样的关联性不是必需的。本文的阵列可以用它们的密度(在一定特定表面面积中的地址的数量)来描述。对于宏阵列来说，阵列密度可以是大约每平方分米一个地址(或在阵列基质的10em乘10cm区域中一个地址)到大约每平方厘米50个地址(在基质的1cm乘lem区域中50个靶)。对于微阵列来说，阵列密度通常为每平方厘米一个或多个地址，例如每平方厘米大约50个、大约100个、大约200个、大约300个、大约400个、大约500个、大约1000个、大约1500个、大约2，500或以上地址。术语“阵列”的使用包括在DNA微芯片技术中发现的阵列。作为一个非限制性的例子，探针可以包含在与可以从Affymetrix，Inc.(SantaClara，CA)商购的GENECHIP产品或相关产品类似的DNA微芯片中。简单来说，DNA微芯片是在玻璃晶圆基质上的微型化的、高密度的探针阵列。选择特定的探针，并设计了光蚀刻掩模，使用在基于固相化学合成和与半导体工业中使用的类似的光蚀刻制造技术的工艺过程中。掩模用于隔离芯片的暴露位点，将探针化学合成在这些位点上，每个探针在阵列中指定的位置上。在制造后，可以将阵列用于杂交。样品中的探针或核酸可以用例如荧光标记物进行标记，在杂交后，可以检测和分析杂交信号。试剂盒本文公开的核酸引物和探针可以用于检测肺炎链球菌的试剂盒的形式提供，包括用于任何上面描述的阵列的试剂盒。在这样的试剂盒中，适合量的一种或多种核酸探针和/或引物(例如本文公开的肺炎链球菌lytA、psaA或ply探针和引物)，被提供在一个或多个容器中，或固定在基质上。核酸探针和/或引物可以被提供成悬浮在水溶液中，或例如作为冷冻干燥的或冻干的粉末。其中提供有核酸的容器可以是任何能够容纳所提供的形式的常规容器，例如微量离心管、安瓿瓶或瓶。试剂盒可以包含标记的或未标记的、用于检测肺炎链球菌核苷酸序列的探针。在某些应用中，一个或多个引物(如上所述)，例如引物对，可以预先测量好的单次使用量提供在独立的、典型情况下用后即可抛弃的管或相当的容器中。使用这样的设置，用于测试肺炎链球菌核酸的存在的样品，可以加入到独立的管中，直接进行扩增。试剂盒中提供的核酸引物的量，可以是任何适合的量，可以依赖于产品所针对的靶市场。例如，如果试剂盒适用于研究或临床应用，提供的每种核酸引物的量，可以是足够引发几个PCR扩增反应的量。确定适合的量的一般性指导，可以在Irmis等、Sambrook等和Ausubel等的文献中发现。试剂盒可以包含两个以上的引物，以便于较大量肺炎链球菌核苷酸序列的PCR扩增。在某些实施方案中，试剂盒可以含有执行PCR扩增反应所必需的反应试剂，包括DNA样品制备试剂、适合的缓冲液(例如聚合酶缓冲液)、盐(例如氯化镁)和脱氧核糖核苷酸(dNTPs)。在试剂盒中也可以提供一个或多个用于PCR反应的对照序列(例如用于检测人类RNAseP)。具体实施方案包括用于基于上面描述的阵列检测肺炎链球菌核酸的试剂盒。这样的试剂盒包含了至少一种特异性针对肺炎链球菌核酸(如上所述)的探针，以及说明书。试剂盒可以含有一种以上不同的探针，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、50,100种或以上的探针。说明书可以包括关于获得样品、处理样品、制备探针和/或将每种探针与样品的等份试样接触的指导。在某些实施方案中，试剂盒包括了用于分离不同的探针的装置，例如独立的容器(例如微量管)或阵列基质(例如96孔或384孔微量滴定板)。在具体实施方案中，试剂盒包括预先包装的探针，例如在独立的容器(例如独立密封的EPPENDORF管)中、或阵列基质的孔中(例如用保护性塑料薄膜密封的96孔微量滴定板)悬浮在适合介质中的探针。在其它具体实施方案中，试剂盒含有用于从样品中提取和/或纯化核苷酸的设备、试剂和说明书。合成寡核苷酸弓|物和探针用于合成寡核苷酸的体外方法对于本领域技术人员来说是公知的；这样的方法可用于生产本公开的方法的引物和探针。体外寡核苷酸合成的最常用的方法是亚磷酰胺方法，由Letsinger提出并由Caruthers进一步发展(Caruthers等，脱氧寡核苷酸的化学合成，(Chemicalsynthesisofdeoxyoligonucleotides),inMethodsEnzymol.154287-313,1987)。这是一种以分步的方式进行的非水性的固相反应，其中单个核苷酸(或修饰的核苷酸)被添加到不断增长的寡核苷酸上。每个核苷酸以反应性的3’-亚磷酰胺衍生物的形式进行添加。也参见Gait主编的《寡核苷酸合成实用方法》(OligonucleotideSynthesis.Apracticalapproach,IRLPress,1984)。一般来说，合成反应如下进行通过酸处理，移除位于不断增长的寡核苷酸链的5’-末端的二甲氧基三苯甲基或等价的保护基团。(不断增长的链通过其3’末端锚定在固相支持物例如硅珠上)。将新释放的寡核苷酸链的5’末端与将要添加到链上的下一个脱氧核苷酸的3’-亚磷酰胺衍生物，使用连接试剂四唑进行连接。连接反应通常以大约99%的效率进行；将任何未反应的5’末端通过乙酰化加帽，以阻断其在随后的连接中的延伸。最后，将通过结合步骤产生的亚磷酸三酯氧化成磷酸三酯，产生了已经被延长一个核苷酸残基的链。将该过程重复，每个循环添加一个残基。参见例如美国专利Nos.4，415，732,4,458，066,4,500，707,4,973，679和5，132，418。使用这种或类似方法的寡核苷酸合成仪是可商购的(例如来自GeneMachines,SanCarlos,CA的PolyPlex寡核苷酸合成仪)。此外，许多公司也进行这样的合成(例如Sigma-Genosys，TheWoodlands,TX；QiagenOperon,Alameda,CA；IntegratedDNATechnologies,Coralville,IA;以及TriLinkBioTechnologies,SanDiego,CA)。提供了下面的实施例来说明某些实施方案的具体特点。但是，下面描述的具体特征不应该被解释为对本发明的范围的限制，而是作为实施例，其等价物可以被本领域的普通技术人员所认识到。实施例实施例1材料和方法本实施例描述了用于确定本公开的探针和引物的特异性和灵敏性的材料和方法。细菌分离株本公开的探针和引物被用于测试对肺炎链球菌的特异性，使用的一组肺炎链球菌包含了67株肺炎链球菌菌株，代表了44种不同的肺炎链球菌血清型(1、2、4、5、6A、6B、7B、7C、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、13、14、15B、15A、15C、16F、17A、17F、18B、18C、18F、19A、19C、19F、20、21、22A、22F、23B、23F、24A、24B、28A、28F、32F、33A、33F、35A、35F、40，以及3株来自结膜炎发作的无荚膜型)，以及104株非肺炎球菌分离株，包括假肺炎链球菌(S.pseudopneumoniae)、缓症链球菌(S.mitis)、口腔链球菌(S.oralis)、血链球菌(S.sanguinis)、副血链球菌(S.parasanguinis)、S.peroris、婴儿链球菌(S.infantis)、革登氏链球菌(S.gordonii)、嵴链球菌(S.cristatus)、唾液链球菌(S.salivarius)、前庭链球菌(S.vestibularis)、澳洲链球菌(S.australis)、中国链球菌(S.sinensis)、寡发酵链球菌(S.oligofermentans)、肠链球菌(S.intestinalis)、化脓性链球菌(S.pyogenes)、无乳链球菌(S.agalactiae)、犬链球菌(S.canis)、咽峡炎链球菌(S.anginosus)、马链球菌马亚种(S.equisubsp.Equi)、马链球菌兽疫亚种(S.equisubsp.Zooepidemicus)、猪链球菌(S.porcinus)、停乳链球菌(S.dysgalactiae)、群集链球菌(S.constellatus)、海豚链球菌(S.iniae)、中间链球菌(S.intermedius)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、沃氏葡萄球菌(S.warneri)、13株尚未鉴定到种的水平的草绿色链球菌、Dolostigranulumpigrum、!^肠球菌(Enterococcusfaecalis)、大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)、月市炎支原体(Mycoplasmapneumoniae)、嗜月市军团菌(Legionellapneumophila)、流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)a_f■禾口NT型、副、流感嗜血杆菌(H.parainfluenzae)>白喉杆菌(Corynebacteriumdiphtheriae)、假结核棒状杆菌(C.pseudotuberculosis)、鼻疽诺卡氏菌(Nocardiafarcinica)、星形诺卡氏菌(N.asteroides)、肺炎克氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)、偶然分枝杆菌(Mycobateriumfortuitum)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、百臼咳杆菌(Bordetellapertussis)和支气管炎博德特菌(B.bronchis印tica)。肺炎链球菌ATCC33400株，在下面描述的所有分析中用作阳性对照。所有的细菌分离株从CDC实验室(链球菌实验室，呼吸道疾病分部和分子测序实验室，脑膜炎禾口疫苗可予页防疾病分部)(StreptococcusLaboratory,RespiratoryDiseasesBranchandMolecularSequencingLaboratory,MeningitisandVaccinePreventableDiseasesBranch)的培养物保藏中心获得。奥普托欣(Optochin)易感性测试(OPT)OPT易感性测试在5%绵羊血琼脂平板上，在5%C02环境下，按照Arbique等中的描述进行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.42:4686_4696，2004，在此以其公开本测试的程度引为参考)。胆汁溶解性(BS)测试试管BS测试按照以前的描述进行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.424686-4696,2004,以及Ruoff等，“链球菌”(Str印tococcusp.405-421)，在P.R.Murray等主编的《临床微生物学手册》(第8版)中(Manualofclinicalmicrobiology8thed.AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C,2003)，二者都在此以其公开本测试的程度引为参考)。DNA探针杂交试验基于rRNA基因序列的ACCUPROBE肺炎链球菌培养鉴定试验，按照制造商的说明书进行(Gen-Probe，SanDiego,CA)。DNA-DNA重新结合细菌细胞的生长、收获和裂解按照以前的描述进行(Arbique等，J.Clin.Microbiol.424686-4696,2004,以及Brenner等，J.Clin.Microbiol.15:1133_1140，1982)。DNA的提取和纯化，以及DNA-DNA重新结合研究，包括通过羟基磷灰石杂交方法确定DNA的相关性，按照Brenner及同事的描述进行(Brenner等，J.Clin.Microbiol.151133-1140，1982)。DNA杂交实验，在DNA重新结合的最适温度55°C和严紧的DNA重新结合温度70°C下进行。相关序列内的趋异水平，通过假定每种程度的异源双链体不稳定性是由1%未配对碱基引起的，来确定。趋异性，被表示为解链温度的变化，是异源DNA双链体相对于同源双链体的热稳定性的降低(单位为摄氏度)。趋异性被计算到最接近的0.5%。临床样本临床样本包括血清、中耳流出物(MEFs)、以及脑脊液(CSFs)，按照⑶C伦理审查委员会(IRB)的规定获取。血清和MEFs从以色列Beer-Sheva的Soroka大学医学院获得。血清样本从15个患有肺炎球菌菌血症的患者，以及15个年龄匹配、种族类型匹配、其鼻咽(NP)培养物对肺炎链球菌阴性的健康对照儿童获得。MEF样本由10个肺炎链球菌培养阳性中耳流出物，以及10个肺炎链球菌培养阴性、但是流感嗜血杆菌(H.influenzae)阳性的MEFs构成。从巴西PortoAlegre的LaboratorioCentraldoEstadodoRioGrandedoSul获得了25个CSFs，由15份来自脑膜炎患者的、对肺炎球菌培养阳性的样本，以及10个来自肺炎球菌阴性、脑膜炎奈瑟菌(N.meningitidis)阳性患者的CSFs。样本在干冰上运输，抵达后冷冻在_70°C。用于实时PCR分析的DNA提取通过修改的QIAGENDNA小提试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)方法，从分离株提取了DNA。简单来说，将一满环从血琼脂平板生长过夜的培养物，重新悬浮在裂解缓冲液中(20mMTris-HCLpH8.0,2.OmMEDTA,1.2%TritonX100，含有0.04g/ml溶菌酶和75U/ml变溶菌素(SigmaChemicalCo,StLouis，M0)，在37°C水浴中温育1小时。剩下的步骤按照制造商的推荐方法进行。对于临床样本来说，将200ill临床材料添加到100ill含有0.04g/ml溶菌酶和75U/ml变溶菌素(SigmaChemicalCo.)的TE缓冲液中，在37°C水浴中温育1小时。所有随后的步骤按照QIAGENDNA小量提取方法手册的描述进行。将DNA洗脱在100u1QIAGENEA洗脱缓冲液中，储存在_20°C。从细菌培养物提取的DNA的浓度，通过NANODROP(NANODROPTechnologies，Wilmington，DE)进行测定。用于lytA、ply和psaA的实时PCRs按照描述进行了两种以前发表过的实时PCR分析方法(Corless等，J.Clin.Microbiol.39:1553_1558，2001；McAvin等，J.Clin.Microbiol.39:3446_3451，2001)。为了开发本文公开的分析方法，根据以前发表的lytA、ply和psaA基因序列以及在GENBANK中可获得的序列，使用PRIMEREXPRESS软件(AppliedBiosystems，AB，FosterCity,CA)设计了寡核苷酸引物和荧光染料标记的探针。探针在5’端用6-羧基荧光素(FAM)进行，或者在psaA探针的情况下用六氯-6-羧基荧光素(HEX)进行标记。黑洞淬灭剂(BHQl，BiosearchTechnologies,Novate,CA)被放置在探针的3，末端，或内部的胸腺嘧啶上(表1)。如果内部淬灭，将3’末端用磷酸基团加帽，以防止探针的延31伸。引物和探针的序列列于表1中。表1、实时PCR引物和探针a,psaA探针被设计为与扩增子的反向链结合b，1表示其上连接有内部BHQ淬灭剂的胸腺嘧啶c，对于多重检测来说，5’末端标记物被改变为CALFlour610分析测试在25u1终反应体积中，使用TAQMANUniversalMasterMix试剂盒(AB)，按照说明书进行，使用了2.5iU样品DNA。对三种分析测试中每种的引物和探针浓度进行了最适化；根据实验性最适化浓度，分别使用了500、200、200nM的psaA-⑶C、lytA-CDC、ply-CDC引物和100、200、200nM的psaA-CDC、lytA-CDC、ply-CDC探针，进行随后的实验。在每次运行中包含了无模板的对照和肺炎链球菌阳性DNA对照(肺炎链球菌ATCC33400)。DNA使用Mx3000P(Stratagene，LaJolla，CA)或7500实时PCR系统(AB)来扩增，使用了下面的循环参数95°C10分钟，然后进行40个循环的95°C15s和60°C1分钟。扩增数据通过仪器软件(STRATAGENE或AppliedBiosystems)来分析。阴性样品被定义为循环阈值大于40。新的分析测试被命名为lytA-CDC、ply-CDC和psaA-CDC。实时PCR分析灵敏度和特异性测定对于检测下限(LLD)的评估来说，制备了来自肺炎球菌参比菌株ATCC33400的纯化的DNA的连续的10倍稀释液(相当于6666到6.6个拷贝)，并使用所有5种实时PCR方案对等份试样进行了测试。通过在所有5种分析测试中测试从67株肺炎链球菌分离株和104株非肺炎球菌分离株(上面列出的)提取的5ng/ul的浓度的DNA，进行了特异性测定。临床样品的实时PCR在血清、MEFs和CSFs中肺炎链球菌DNA的检测，对于所有分析测试来说在同样样本的等份试样上平行进行。将从血清、MEFs或CSF提取的DNA(2.5u1未稀释的或2.5yl13稀释的)，使用在扩增反应中。每种临床样品的所有分析测试进行三份平行样。如果三份平行样中的两份在小于40个循环的截止期内给出阳性结果，样本被认为是阳性的。分析测试方案如上所述。对于每种样品，独立地进行了RNaseP人类基因对照反应，以检查抑制剂的存在。在该反应中不能得到扩增，被认为表明了抑制剂。用于psaA-CDC、lytA-CDC和ply-CDC的多重实时PCRs将三组引物和探针合并成单一反应混合物，用于多重检测。对单一基因检测分析方法的修改包括使用QIAGEN的QUANTITECT多重PCRNoROXMaster混合物，将ply-CDC基因探针的荧光标记物从FAM改变成5，CALFLOURRED610、3，BHQ2(BiosearchTechnologies)，将lytAFAM探针的浓度从原始的200nM降低到100nM。温度和循环数保持与原始的单一PCR方案中描述的相同。实施例2用于肺炎链球菌检测的分析方法的检测下限本实施例描述了用于确定本公开的探针和引物的灵敏度的方法，以及使用这样的探针和引物与Corless等和McAvin等描述的探针和引物组的方法的比较。通过扩增来自阳性对照菌株肺炎链球菌ATCC33400的纯化提取的基因组DNA的系列稀释物，测量了5种分析方法的分析检测下限(LLD)。所有5种分析测试在使用它们相应的引物对和探针时显示了高度灵敏性，检测下限相当于小于10个拷贝，除了psaA-CDC之外，它具有大约低2倍的灵敏度。产生的所有标准曲线都具有-3.4到-3.2的斜率，R2>0.96。分析测试的效率非常相似，在96%到100%的范围内。对于5种方法扩增来自代表了45种血清型和不能分型的肺炎链球菌的67株肺炎链球菌菌株组的DNA的能力进行了评估，结果从所有测试的肺炎链球菌菌株中100%扩增或检测到了DNA。实施例3分析测试对于肺炎链球菌检测的特异性本实施例描述了用于确定本公开的探针和引物的特异性的方法，以及使用这样的探针和引物与Corless等和McAvin等描述的探针和引物组的方法的比较。通过对来自104株非肺炎球菌细菌菌株的提取的DNA进行扩增，评估和比较了5种分析测试中每种的分析特异性。这些菌株代表了革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的几个属，它们中的某些栖息在口腔中。在特异性组中，使用任何非链球菌时没有发生扩增。但是，使用某些P-LVS和假肺炎链球菌菌株时发生了扩增。P-LVS是从提交到链球菌实验室的菌株中特意选出的，使用标准的方法学标准难以鉴定或分类。除了BS、OPT和ACCUPROBE之外，还对这些分离株进行了DNA/DNA重新结合分析。DNA/DNA重新结合值表明，这些P-LVS和假肺炎链球菌(表2)不是肺炎链球菌。紧温度)下；D，被计算到最接近的0.5%的趋异值；nd，未做；AL，阿拉斯加州；AZ，亚利桑那州；MD，马里兰州；NS-CA，加拿大新斯科舍(NovaScotia)0使用实时PCR对这些菌株进行的分析证明，新的lytA-⑶C实时PCR分析测试是最特异的(100%)，显示出使用特异性组中的非肺炎链球菌生物体的DNA时没有可检测的荧光信号(表2)。其次是psaA-CDC实时PCR(98%)，它对于两个假肺炎链球菌菌株给出了阳性结果，McAvin等发表的psaA-McAvin实时PCR(96%)，它对4株假肺炎链球菌阳性。使用psaA-McAvin、lytA-CDC和psaA-CDC引物探针组，使用来自P-LVS的DNA时没有发生扩增(表2)。对ply肺炎链球菌基因进行了两种分析测试对所有假肺炎链球菌都给出了阳性反应；在其它P-LVS中，使用ply(13个之中有13个)和ply-⑶C(13个之中有10个)分析测试都发生了阳性反应，使得最终特异性分别为78%和81%。lytA-CDC和psaA-CDC实时PCR都是高度特异性的，使用P-LVS分离株时没有显示出扩增。psaA-CDC实时PCR特异性略低，扩增了两株假肺炎链球菌。这些结果与较早的使用常规PCR的研究相一致，显示了这些基因在辨别肺炎链球菌中的用途。实施例4在临床样品中检测肺炎链球菌本实施例描述了使用公开的探针和引物在临床样品中检测肺炎链球菌，以及使用这样的探针和引物与Corless等和McAvin等描述的探针和引物组的方法的比较。在三种类型的临床样本(上面描述的)上使用了5种分析测试，以对分析测试进行评估和比较(表3)。表3、所有5种实时PCRs对临床样本的分析测试结果aMEF，中耳流出物；CSF，脑脊液b一种血清为RNaseP基因阴性c对于psaA-McAvin、lytA-CDC、ply-CDC来说，Ct平均值=彡38d对于该一个样本测试的所有5个PCR来说，Ct值彡37所有5种分析测试都显示出出色的关联性。当样本在一种分析测试中是阳性或阴性时，同样的样本在其它分析测试中一般也是阳性或阴性的。区别只在于每种分析的阳性或阴性的总数。灵敏度根据15个培养阳性的血清样本来计算，尽管其中有一个是RNaseP阴性的，表明了存在抑制。血清样品的灵敏度，对于lytA-⑶C和ply-⑶C来说是53%(8/15)(对于每种但不同的样本来说有1个附加的阳性)，对于lytA和psaA来说是47%(7/15)，对于肺炎链球菌ply来说是40%(6/15)。肺炎链球菌培养物阴性的血清的分析，在分析之间显示出良好的相关性以及良好的特异性。对于psaA、lytA和ply来说，没有发生阳性，使用血清时获得了100%的特异性。MEFs和CSFs的分析显示，所有5种分析测试对于所有10个Spn阳性MEFs和所有15个CSFs给出了阳性结果，产生了100%的灵敏性。10个培养物阴性的MEFs的特异性评估，对于同样的六个MEF样本，psaA-CDC、psaA-McAvin、lytA-CDC和ply-Corless实时PCR分析产生了阳性，得到了40%的特异性。此外一个附加的样本被ply-CDC检测为阳性，特异性为30%。肺炎链球菌阴性CSFs的检查显示出良好的特异性。对于psaA来说阳性为10个中有1个(90%特异性)，对于psaA-McAvin、ply-CDC和ply-Corless来说为10个中有2个(80%特异性)，对于lytA-⑶C来说为10个中有3个(70%特异性)。实施例5psaA、lyU和ply的多重CDC实时PCRs本实施例描述了在多重实时PCR分析中使用公开的探针和引物检测肺炎链球菌。为了确定将引物探针组组合并在一起一次检测所有三种基因是否能够有利地改进灵敏性，我们构建了三种新开发的分析方法的多重复合。使用已知浓度的肺炎球菌阳性对照ATCC33400的连续稀释物进行了LLD评估，并将结果与每种基因的单式分析测试进行了比较。这些研究显示，当与所有单式PCR进行比较时，偏差小于士1Ct值(当荧光值超过阈值时的循环数)。假肺炎链球菌和其它P-LVS细菌的评估获得的结果与单独分析测试相同。没有附加的阳性或阴性反应。目前，趋势是进行多重分析测试以同时检测各种不同的病原体，这代表了时间和金钱的节省。我们对于单一病原体进行了这种尝试但是提议我们的lytA-⑶C或psaA-⑶C引物探针组，将在多重复合了用于检测其它呼吸道病原体的引物和探针的呼吸道平台中，提供高的特异性。这种执行的多重化和速度的潜力，使得这些分析测试成为用于分子检测和流行病学携带研究的有希望的工具。当与用于肺炎球菌疾病诊断的其它分析方法一起使用时，本技术的使用将提供附加的优点。尽管在对本公开进行描述时强调了具体的实施方案，但是对于本领域技术人员来说，显然也可以使用具体实施方案的变化形式，并且也已计划到本公开的内容可以在本文的具体描述之外进行实践。与本发明的具体方面、实施方案或实施例一起进行描述的特征、特性、化合物、化学基团或例子，应该被理解为适用于本发明的任何其它方面、实施方案和实施例。因此，本公开包括了在下面的权利要求书中定义的本公开的精神和范围所涵盖的所有修改。3权利要求用于在样品中检测肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)核酸的方法，包括将样品与至少一种探针接触，该探针含有长度在20到40个核苷酸之间、能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDNO13或SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交的核酸序列，其中探针包含与显示为SEQIDNO5、SEQIDNO6或SEQIDNO12的核苷酸序列具有至少95％同一性的核酸序列；以及检测肺炎链球菌核酸与探针之间的杂交，其中杂交的检测表明在样品中存在肺炎链球菌核酸。2.权利要求1的方法，其中探针基本上由显示为SEQIDN0:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO:12的核酸序列组成。3.权利要求2的方法，其中探针由X-GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO5)或X-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO6)组成，其中X是荧光团，其中Y是暗淬灭剂或受体染料。4.权利要求2的方法，其中探针由X-CTCAAGT“T”GGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA-Y(SEQIDNO12)组成，其中X是荧光团，Y是一个或多个磷酸酯，“T”是连接有暗淬灭剂或受体染料的胸腺嘧啶。5.权利要求1到4任一项的方法，其中探针被标记。6.权利要求5的方法，其中探针被放射性标记、荧光标记、生物素标记、酶法标记或化学标记。7.权利要求5或6的方法，其中探针用荧光团标记。8.权利要求5到7任一项的方法，其中探针用荧光淬灭剂标记。9.权利要求5到8任一项的方法，其中检测杂交包括检测杂交过程中或之后来自标记探针的信号，相对于杂交之前来自标记物的信号的变化。10.权利要求1到9任一项的方法，其中所述方法将肺炎链球菌核酸与类似肺炎球菌的草绿色链球菌(P-LVS)核酸区分开来。11.权利要求1到10任一项的方法，还包括通过聚合酶链反应(PCR)、实时PCR、反转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)、实时反转录酶-聚合酶链反应(rtRT-PCR)、连接酶链反应或转录介导的扩增(TMA)，来扩增肺炎链球菌核酸。12.权利要求11的方法，其中肺炎链球菌核酸通过实时PCR来扩增。13.权利要求11或12的方法，其中肺炎链球菌核酸的扩增包括将样品与至少一种引物接触，该引物长度在15到40个核苷酸之间，能够在非常高严紧性条件下，与显示为SEQIDN0:13或SEQIDNO:15的肺炎链球菌核酸序列杂交，其中引物能够扩增肺炎链球菌核酸。14.权利要求13的方法，其中引物包含与显示为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10或SEQIDNO11的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。15.权利要求14的方法，其中引物基本上由显示为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10或SEQIDNO11的核酸序列组成。16.权利要求1到15任一项的方法，其中样品是从对象获得的生物样品。17.权利要求16的方法，其中肺炎链球菌核酸在生物样品中的存在，表明在从对象获得的生物样品中存在肺炎链球菌感染。18.权利要求16到17任一项的方法，其中生物样品获自血液、血清、脑脊液、中耳流出物，支气管肺泡灌洗物、气管吸出物、痰液、鼻咽吸出物、口咽吸出物或唾液。19.权利要求1到18任一项的方法，其中探针排列在具有可寻址的位置的预定阵列上。20.一种用于检测肺炎链球菌核酸的探针，含有长度在20到40个核苷酸之间、能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDNO:13或SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交的核酸序列，其中探针含有与显示为SEQIDNO:5、SEQIDNO6或SEQIDNO12的核苷酸序列有至少95%同一性的核酸序列。21.权利要求20的探针，其中探针基本上由显示为SEQIDNO:5、SEQIDNO:6或SEQIDNO12的核酸序列组成。22.权利要求21的探针，其中探针由X-GCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO5)或X-TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAG-Y(SEQIDNO:6)组成，其中X是荧光团，其中Y是暗淬灭剂或受体染料。23.权利要求21的探针，其中探针由X-CTCAAGT"T”GGAAACCACGAGTAAGAGTGATGAA-Y(SEQIDNO12)组成，其中X是荧光团，Y是一个或多个磷酸酯，“T”是连接有暗淬灭剂或受体染料的胸腺嘧啶。24.权利要求20到23任一项的探针，其中探针被标记。25.权利要求24的探针，其中探针被放射性标记、荧光标记、生物素标记、酶法标记或化学标记。26.权利要求24或25的探针，其中探针用荧光团标记。27.权利要求24到26任一项的探针，其中探针用荧光淬灭剂标记。28.一种用于扩增肺炎链球菌核酸序列的引物，含有长度为15到40个核苷酸，能够在非常高严紧性条件下与显示为SEQIDN0:13或SEQIDNO15的肺炎链球菌核酸序列杂交的核酸，含有与显示为SEQIDN0:3、SEQIDN0:4、SEQIDNO10,SEQIDNO11的核酸序列有至少95%同一性的核酸序列，其中引物能够指导肺炎链球菌核酸的扩增。29.权利要求28的引物，其中引物基本上由显示为SEQIDNO:3、SEQIDNO:4、SEQIDNO10,SEQIDNO11的核酸序列组成。30.用于扩增肺炎链球菌核酸的引物组，含有一种或多种正向引物，基本上由显示为SEQIDNO:3或SEQIDNO10的核酸序列组成；以及一种或多种反向引物，基本上由显示为SEQIDNO:4或SEQIDNO11的核酸序列组成，其中引物组能够与肺炎链球菌核酸杂交并指导其扩增。31.权利要求30的引物组，其中引物组是一个或多个引物对的组，其中一个或多个引物对含有基本上由显示为SEQIDNO:3的核酸序列组成的正向引物，以及基本上由显示为SEQIDNO4的核酸序列组成的反向引物；基本上由显示为SEQIDNO:10的核酸序列组成的正向引物，以及基本上由显示为SEQIDNO11的核酸序列组成的反向引物；或其组合。32.用于在样品中检测肺炎链球菌的试剂盒，含有权利要求20到27任一项的探针；以及用于将探针与样品中的肺炎链球菌核酸进行杂交的说明书。33.权利要求32的试剂盒，还含有权利要求30的引物。34.用于在样品中检测肺炎链球菌的装置，包括含有权利要求20到27任一项的至少一种探针的核酸阵列。35.用于在怀疑具有肺炎链球菌感染的对象中诊断肺炎链球菌感染的方法，包括从对象获得含有核酸的样品；将样品与权利要求20到27任一项的一种或多种核酸探针接触；检测样品中存在的肺炎链球菌核酸序列与探针之间的杂交，其中检测到杂交表明对象被肺炎链球菌感染。36.权利要求35的方法，还包括使用权利要求30的一种或多种引物扩增肺炎链球菌核酸。全文摘要公开了用于检测肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae(S.pneumoniae))的方法。筛选怀疑含有肺炎链球菌核酸的样品中是否存在该核酸。肺炎链球菌核酸的存在表明肺炎链球菌的存在。确定样品中是否存在肺炎链球菌，可以通过检测肺炎链球菌探针、例如肺炎链球菌lytA探针、肺炎链球菌psaA探针或肺炎链球菌ply探针，之间的杂交来完成。还公开了用于检测肺炎链球菌的探针和引物。还公开了含有所公开的探针和/或引物的试剂盒和阵列。文档编号C12Q1/68GK101855362SQ200880024577公开日2010年10月6日申请日期2008年5月16日优先权日2007年5月18日发明者玛丽亚·达·格洛娅·西凯拉·卡瓦略,玛丽亚·露西娅·通代拉,莱斯莉·麦吉申请人:美国政府健康及人类服务部，疾病控制和预防中心