变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu的纯化方法
【专利摘要】本发明提供一种变形链球菌重组亚单位基因工程获选疫苗抗原Glu的纯化方法，包含步骤：收集发酵的变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗Glu蛋白的大肠杆菌菌体，采用高压匀浆破菌，收集上清，离心上清，收集沉淀；包涵体洗涤；包涵体裂解：用含尿素的PBS缓冲液重悬，离心，弃沉淀，保存上清；初步复性：取含尿素的PB缓冲液，将包涵体溶解液逐滴缓慢加入到上述搅拌的缓冲液中，离心，弃沉淀，上清上柱纯化；亲和层析纯化：在含尿素的PB缓冲液条件下对目的蛋白进行纯化，目的蛋白与填料结合后，用含氟化钠的PB缓冲液进行酶切洗脱，收集洗脱液即为层析纯化的Glu蛋白。采用本发明的方法纯化的抗原纯度高，工艺简捷。
【专利说明】变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu的纯化方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药领域，涉及一种重组变形链球菌龋齿疫苗候选抗原Glu制备中的纯化方法。
【背景技术】
[0002]龋病是在以细菌为主的多种因素作用下，牙齿硬组织发生的慢性、进行性破坏的一种感染性疾病。其特点是发病率高，分布广。一般平均龋患率可在50%左右，是口腔主要的常见病，也是人类最普遍的疾病之一，世界卫生组织已将其与癌肿和心血管疾病并列为人类三大重点防治疾病。
[0003]目前研究认为细菌是龋病发生的必要条件，一般认为致龋菌有两种类型，一种是产酸菌属，其中主要为变形链球菌、放线菌属和乳杆菌，可使碳水化合物分解产酸，导致牙齿无机质脱矿；另一种是革兰氏阳性球菌，可破坏有机质，经过长期作用可使牙齿形成龋洞。目前公认的主要致龋菌是变形链球菌。
[0004]自20世纪80年代以来，人们就开始用变形链球菌的有效抗原成分来制备亚单位防龋疫苗。传统的灭活死疫苗和减毒活疫苗虽可抑制变形链球菌对牙面的粘附，但全细胞诱导的抗体与心肾组织有交叉反应，减毒活疫苗具有减毒不充分或毒力回复则可造成对机体的伤害而均难以应用于临床。随后多种以S.Mutans抗原为基础的防龋疫苗可显著降低动物龋齿发生率，抗原主要有:表面蛋白抗原I/II(Ag 1/11)、葡糖基转移酶(GTF)和葡聚糖结合蛋白(GBP)等抗原分子(Hajishengallis G.1nfectImmun,1998，66(4):1740-1743;Katz J.1nfect Immun, 1993，61 (5):1964-1971;Childers NK.0ral Microbiol Immunol, 2006，21 (5):309-313;Childers NK.J DentRes, 2002, 81(I):48-52.;Peacock ZS.0ral Microbiol Immunol, 2005, 20 (I):60-64;SmithD J.1nfect Immun, 2005，73(5):2797-2804)。
[0005]葡糖基转移酶(Glucosyltransferase, GTF)是变形链球菌合成的重要致频因子，催化鹿糖合成包括葡聚糖在内的多种胞外多糖。GTF结构包括催化区(Catalytie,Cat)和葡聚糖结合区(Glucan binding, Glu)两个功能区段。催化活性区具有催化蔗糖水解的活性，能够催化蔗糖产生葡聚糖；葡聚糖结合区与葡聚糖结合，这种结合是特异性，不可逆的，且结合力非常强，由此介导了变形链球菌之间、菌体与葡聚糖、菌体与牙面之间的相互作用，从而使变形链球菌粘附、聚集在牙齿的表面并产酸，酸引起牙齿表面脱矿，最终导致龋病的发生，是龋病发生的主要因素。Glu具有良好的免疫原性和免疫保护性，其可高效诱导抗GTF抗体,从而抑制GTF合成葡聚糖的能力，减少菌斑形成。(Xu QA, Vaccine.2007Jan26;25(7):1191-5 ；Jespersgaard C，Infect Tmmun.1999Feb;67(2):810-6 ；Taubman MA, InfectImmun.2001Jul; 69 (7):4210-6.)因此，抑制GTF催化合成葡聚糖有可能预防龋病的发生。
【发明内容】
[0006]本发明的目的，是提供一种变形链球菌重组亚单位基因工程获选疫苗抗原Glu的纯化方法。采用本发明的方法纯化的抗原Glu(其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)，其纯度> 90%，完成整个纯化过程后无需额外再置换缓冲液，是一种工艺简捷、所获得目标蛋白纯度高、回收率较好的纯化方法。
[0007]本发明提供的一种变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu的纯化方法，其主要包含步骤:
[0008]I)收集菌体、破菌:收集发酵的变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗Glu蛋白的大肠杆菌菌体，采用高压匀浆破菌，收集上清，离心上清，收集沉淀；
[0009]2)包涵体洗涤:将步骤I)收集的沉淀，用PBS缓冲液重悬，洗涤多次，然后离心，收集沉淀；
[0010]3)包涵体裂解:用含尿素的PBS缓冲液重悬，离心，弃沉淀，保存上清；
[0011]4)初步复性:取含尿素的PB缓冲液，将包涵体溶解液逐滴缓慢加入到上述搅拌的缓冲液中，离心，弃沉淀，上清上柱纯化；
[0012]5)亲和层析纯化:选择蛋白纯化系统，在含尿素的PB缓冲液条件下对目的蛋白进行纯化，目的蛋白与填料结合后，用含氟化钠的PB缓冲液进行酶切洗脱，收集洗脱液即为层析纯化的Glu蛋白。
[0013]变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu的纯化方法，进一步包含以下步骤:
[0014]6)透析浓缩:将纯化的Glu蛋白置于透析袋中，封口，悬浮于装有含尿素的PB缓冲液中，搅拌透析，取出透析袋用高分子聚合物撒在透析袋外，待体积浓缩后，取出。
[0015]变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu的纯化方法，进一步还包含步骤:
[0016]7)加入助溶剂:加入L-精氨酸、甘油、海藻糖或PEG后保存。
[0017]优选地，步骤I)具体为:将发酵的变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗Glu蛋白的大肠杆菌菌体用PH7.0-7.5的10-20mmol/L PBS缓冲液按1:9比例混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，破碎后的样品经750 X g离心30分钟，收集上清，上清再以13000 X g离心30分钟，收集沉淀。
[0018]优选地，步骤2)具体为:将离心沉淀用9倍体积含有1% TRITON X-100的PBS缓冲液重悬，充分混匀，用搅拌器温和搅拌30分钟，再以10000 X g离心30分钟，弃上清，沉淀再重复洗涤一次；将离心沉淀用9倍体积含有lmol/L尿素的PBS缓冲液重悬，充分混匀后，弃上清，沉淀再重复洗涤一次，离心后收集沉淀。
[0019]优选地，步骤3)具体为:每克包涵体用19ml含8M尿素的PBS缓冲液重悬，4°C温和搅拌12h，13000G离心30分钟，弃沉淀，上清4°C保存。
[0020]优选地，步骤4)具体为:取一定体积的含2M尿素pH7.0I OOmmo I/L PB的缓冲液，并置于搅拌器搅拌，将包涵体溶解液逐滴缓慢加入到上述搅`拌的缓冲液中，13000g离心30分钟，弃沉淀，上清上柱纯化。
[0021]优选地,步骤5)具体为:选择Profinity eXactTM蛋白纯化系统进行纯化,使用含2mol/L尿素的pH7.0100mmol/L PB缓冲液条件下对目标蛋白进行纯化，目的蛋白与填料结合后，用含lOOmmol/L氟化钠的PB缓冲液进行酶切洗脱，收集洗脱液即为层析纯化的Glu蛋白。
[0022]优选地，步骤6)具体为:将纯化的Glu蛋白置于丽10000的透析袋中，封口。悬浮于装有含Imol尿素pH7.0的lOOmmol/L PB缓冲液中，4°C搅拌透析10小时；更换缓冲液为不含尿素的100mmol/L PB缓冲液，4°C搅拌透析10小时；取出透析袋用高分子聚合物或蔗糖撒在透析袋外，待体积浓缩20倍体积后，取出。
[0023]优选地，高分子聚合物为聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
[0024]所述抗原是通过以下步骤制备的:
[0025]I)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu蛋白活性片段的核酸序列；
[0026]2)将步骤I)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌；
[0027]3)诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。
[0028]本发明所述的上述方法的优点是:
[0029]步骤I)中，所采用生产或中试纯化中的60_80MPa高压匀浆破菌技术，破菌率大于96%，通过差速离心取出破菌碎片后，再进行高速离心获取包涵体蛋白。
[0030]步骤4)中:所述的蛋白初步复性，将包涵体溶解液中的尿素通过稀释复性的方式从8mol/L的浓度缓慢降至2mol/L左右，在此过程中，由于尿素浓度的降低至2M，包涵体蛋白得到初步复性的作用，蛋白`的终浓度控制在0.05-0.lmg/ml左右，避免因蛋白浓度过高，分子间作用力加大，造成蛋白质分子间聚合趋向增大，而形成寡聚体和多聚体产生沉淀。
[0031]步骤5)中:所述的亲和层析纯化,所使用的填料为Profinity eXact融合标签系统，通过氟化钠将纯化和去除标签合为一体，简化纯化过程。
[0032]步骤6)中:所述透析浓缩的方法可采用透析袋法或中空纤维柱法进行，满足工艺放大的要求。
[0033]采用本发明所述纯化方法主要有包涵体洗涤和裂解、稀释复性、亲和层析、透析浓缩。通过上述工艺处理不同批次的Glu作12%SDS-PAGE，呈现出单一目标蛋白条带，分子量约为43kD，纯度在90%以上。等电点在pH9.1左右。纯化后的Glu与LTB佐剂共同滴鼻免疫Waster大鼠，发现Glu加免疫佐剂组抗原特异性唾液slgA和血清中的IgG水平显著高于阴性对照组(PBS组)(P〈0.0I)，证明使用本发明纯化方法获得的Glu可有效刺激机体产生较高的免疫应答。
[0034]为让本发明的上述和其它目的、特征和优点能更明显易懂，下文特举较佳实施例，并配合附图，作详细说明如下。
【专利附图】
【附图说明】
[0035]图1为Glu基因PCR扩增结果图，图中，泳道1:核酸(DNA)分子量标准(天根Marker III);泳道 2-3:为 Glu PCR 产物；
[0036]图2为BamH I和Not I双酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定结果，图中，泳道1:核酸(DNA)分子量标准(天根Marker III);泳道2_3:重组表达质粒pPAL7_Glu经双酶切后的鉴定结果，酶切后分离的片段5900bp和1140bp ；
[0037]图3为重组Glu工程菌IPTG诱导表达图，其中泳道I重组工程菌(pPAL7_Glu/XLlBlue)诱导前；泳道2为蛋白质分子量标准(Fermentas，#SM0671);泳道3-7分别为重组工程菌诱导l_5h ；
[0038]图4为Glu蛋白亲和层析及氟化钠酶切SDS-PAGE结果图，图中，泳道1:重组Glu包涵体蛋白样品；泳道2:上柱流穿样品；泳道3:蛋白质分子量标准(Fermentas,#SM0671);泳道4-9:氟化钠酶切后洗脱样品；泳道10:磷酸清洗后的洗脱样品；
[0039]图5为Glu蛋白亲和层析纯化层析图；其中峰I为流穿峰，峰2为目的蛋白洗脱峰，峰3为磷酸清洗峰。
【具体实施方式】
[0040]下面结合实施例对本发明作详细描述:
[0041 ] 实施例1抗原Glu的制备
[0042](一)变形链球菌Glu基因的克隆
[0043]1.变形链球菌UA159(来源于美国模式菌种收集中心，ATCC)(中国人民解放军第三军医大学临床微生物学及免疫学教研室保存)
[0044]2.液氮罐中取出保存的变形链球菌UA159菌株涂布于BHI固体培养基上，于37°C，培养过夜。基因组抽提试剂盒抽提变形链球菌基因组。
[0045]3.采用PCR方法自变形链球菌基因组分别扩增Glu的编码基因。
[0046]1)引物设计合成如下(下划线示酶切位点碱基序列)
[0047]根据GenBank公布的基因序列及引物设计原则，设计相应的引物，引入酶切位点。
[0048]2 )目的基因的PCR扩增:
[0049]
【权利要求】
1.一种变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原GlU的纯化方法，其特征在于，包含步骤: O收集菌体、破菌:收集发酵的变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗Glu蛋白的大肠杆菌菌体，采用高压匀浆破菌，收集上清，离心上清，收集沉淀； 2)包涵体洗涤:将步骤I)收集的沉淀，用PBS缓冲液重悬，洗涤多次，然后离心，收集沉淀； 3)包涵体裂解:用含尿素的PBS缓冲液重悬，离心，弃沉淀，保存上清； 4)初步复性:取含尿素的PB缓冲液，将包涵体溶解液逐滴缓慢加入到上述搅拌的缓冲液中，离心，弃沉淀，上清上柱纯化； 5)亲和层析纯化:选择蛋白纯化系统，在含尿素的PB缓冲液条件下对目的蛋白进行纯化，目的蛋白与填料结合后，用含氟化钠的PB缓冲液进行酶切洗脱，收集洗脱液即为层析纯化的Glu蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含步骤: 6)透析浓缩:将纯化的Glu蛋白置于透析袋中，封口，悬浮于装有含尿素的PB缓冲液中，搅拌透析，取出透析袋用高分子聚合物撒在透析袋外，待体积浓缩后，取出。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，进一步包含步骤: 7)加入助溶剂:加入L-精氨酸、甘油、海藻糖或PEG后保存。
4.根据权利要求1至3`任一项所述的方法，其特征在于，步骤I)具体为:将发酵的变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗Glu蛋白的大肠杆菌菌体用pH7.0-7.5的10-20mmol/LPBS缓冲液按1:9比例混匀悬浮，预冷后采用高压匀浆破菌，破碎后的样品经750Xg离心30分钟，收集上清，上清再以13000 Xg离心30分钟，收集沉淀。
5.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤2)具体为:将离心沉淀用9倍体积含有1% TRITON X-100的PBS缓冲液重悬，充分混匀，用搅拌器温和搅拌30分钟,再以10000 Xg离心30分钟，弃上清，沉淀再重复洗涤一次；将离心沉淀用9倍体积含有lmol/L尿素的PBS缓冲液重悬，充分混匀后，弃上清，沉淀再重复洗涤一次，离心后收集沉淀。
6.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)具体为:每克包涵体用19ml含8M尿素的PBS缓冲液重悬，4°C温和搅拌12h，13000G离心30分钟，弃沉淀，上清4°C保存。
7.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤4)具体为:取一定体积的含2M尿素pH7.0IOOmmoI/L PB的缓冲液，并置于搅拌器搅拌，将包涵体溶解液逐滴缓慢加入到上述搅拌的缓冲液中，13000g离心30分钟，弃沉淀，上清上柱纯化。
8.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤5)具体为:选择Profinity eXactTM蛋白纯化系统进行纯化，使用含2mol/L尿素的pH7.0I OOmmo I/L PB缓冲液条件下对目标蛋白进行纯化，目的蛋白与填料结合后，用含100mmol/L氟化钠的PB缓冲液进行酶切洗脱，收集洗脱液即为层析纯化的Glu蛋白。
9.根据权利要求1至3任一项所述的方法，其特征在于，步骤6)具体为:将纯化的Glu蛋白置于丽10000的透析袋中，封口。悬浮于装有含Imol尿素pH7.0的100mmol/L PB缓冲液中，4°C搅拌透析10小时；更换缓冲液为不含尿素的100mmol/L PB缓冲液，4°C搅拌透析10小时；取出透析袋用高分子聚合物或蔗糖撒在透析袋外，待体积浓缩20倍体积后，取出，所述高分子聚合物为聚乙二醇或聚乙烯吡咯烷酮。
10.根据权利要求1至9任一所述的纯化方法，其特征在于，所述抗原是通过以下步骤制备的: . 1)设计正向引物和反向引物通过PCR扩增或全基因合成以获得编码变形链球菌重组亚单位基因工程疫苗候选抗原Glu蛋白活性片段的核酸序列； . 2)将步骤1)所获得的核酸序列克隆至表达载体构建重组载体，然后将该重组载体转化至宿主菌； . 3 )诱导转化后的宿主菌表达重组蛋白。
【文档编号】C12R1/19GK103820414SQ201410082929
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】张卫军, 刘开云, 付强, 邹全明, 郭刚, 张怡, 孙红武, 付启欢, 樊绍文, 卢陆, 高莺 申请人:重庆原伦生物科技有限公司, 中国人民解放军第三军医大学