一种生产低极性人参皂苷的方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及一种生产低极性人参皂苷的方法，属于天然产物加工领域。
【背景技术】
[0002]人参为五加科植物人参的干燥根，多生长于昼夜温差小的海拔500?1100米山地缓坡或斜坡地的针阔混交林或杂木林中。由于根部肥大，形若纺锤，常有分叉，全貌颇似人的头、手、足和四肢，故而称为人参。人参被称为“百草之王”，是驰名中外、老幼皆知的名贵药材。长期以来，由于过度采挖，资源枯竭，人参赖以生存的森林生态环境遭到严重破坏，目前东北参也处于濒临绝灭的边缘。东北的野生人参也极罕见，因此，保护本种的自然资源有其特殊的重要意义。
[0003]人参具有多种生理和药理作用，如抗肿瘤、增强免疫、改善微循环、安神、抗衰老、增强记忆及学习能力等。
[0004]在抗肿瘤方面，人参具有:①抑制肿瘤细胞生长、促进肿瘤干细胞分化;②抑制肿瘤细胞的浸润和转移;③抑制肿瘤诱导的新生血管生成;④降低化疗药物的毒副作用。
[0005]野生人参即含有和栽培人参相同的人参皂苷(称为天然人参皂苷)，又含有独特的人参皂苷(称为稀有人参皂苷和苷元)，野生人参的功效源于稀有人参皂苷和苷元。食用人参后，其中的二醇型原始人参皂苷只有4%能在肠道转化成稀有人参皂苷和苷元、被机体吸收利用，其余96%以粪便形式排除。为提高栽培人参中稀有人参皂苷和苷元的含量，人们采用多种方法对人参进行加工。
[0006]①第一代人参加工技术:将人参蒸制，使人参皂苷受热分解，失去部分糖基，形成稀有人参皂苷。我们常见的红参，以及世界著名的进口红参都是采用这一技术得到的产品。
[0007]②第二代人参加工技术:利用有机酸、无机酸、碱破坏人参皂苷的糖苷键，生成稀有人参皂苷。
[0008]③第三代人参加工技术:根据酶的专一性将不同构型、不同种类的糖苷键降解，达到定向水解目的，该法维持在实验室水平。
[0009]④第四代人参加工技术:是将不同降解能力的微生物组合催化分解，将底物转化为目标产物的过程，其根本为微生物与外源底物间发生的酶促反应。很难选取高活性工程菌，该领域已历经30多年的发展，还未见产业化应用的报道。
[0010]国际上，美国专利(5776460)报道了经120-180°c处理0.5-20小时后，人参中稀有人参皂苷含量有所提高。该专利仅仅是控制温度，人参热解产物的质和量均无法恒定，产品稳定性无法保证，产品中稀有人参皂苷的含量较低、批次差异大。
【发明内容】
[0011]本发明的目的是提供一种生产低极性人参皂苷的方法。本发明人参加工方法能够产生25-羟基达玛烷和25-羟基达玛烯，本发明通过精细控制催化分解进程，提取皂苷的产量和组分是可控的，从处理后的人参等原料中提取的目标产物产率高。
[0012]本发明提供的生产低极性人参皂苷的方法，包括如下步骤:将含人参皂苷的植物、所述植物的组织培养物、所述植物的提取物和/或天然人参皂苷的原料经催化分解，然后分离，即得到低极性人参皂苷；
[0013]所述低极性人参皂苷为25-羟基达玛烷组物质和下述(1)-(5)中至少一组物质的混合物:
[0014](I)25-羟基达玛烯组:3β，12β，25-三羟基达玛20(22)烯、3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-30，120，25-三羟基达玛20(22)烯和3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-(1—2)-3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-3β，12β，25-三羟基达玛20 (22)烯中的至少一种；
[0015](2)稀有二醇皂苷I组:20-(S，R)-Rg3、20-(S，R)-Rh2、20-(S，R)-Pro 和人参二醇中的至少一种；
[0016](3)稀有二醇皂苷II组:Rg5和/或Rk3 ；
[0017](4)三醇I组:20-(S，R)_原人参三醇和/或人参三醇；
[0018](5)三醇11组:20-(5，10-1^2、20-(5，10-1^6、诎4和1^5中的至少一种；
[0019]所述25-羟基达玛烷组:30，120，20(3，10，25-四羟基达玛烷、3-0-0-0-吡喃葡萄糖基_3β，12β，20(S，R)，25_四轻基达玛烧和3-0-β-?-卩比喃葡萄糖基-(I—2)-3_O-0-D-卩比喃葡萄糖基_3β，12β，20(S，R)，25-四羟基达玛烷中的至少一种。
[0020]上述的方法中，所述植物为人参、三七、西洋参和绞股蓝中的至少一种；
[0021]所述植物采用须、根、茎、叶、花、果实和芦头中的至少一个部位；
[0022]所述天然人参皂苷为肋1、肋2、肋3、此、1?(1、1^1、1^和1?2中至少一种；
[0023]所述催化分解采用的催化剂为菌、酶、有机酸和有机碱中的至少一种。
[0024]上述的方法中，所述菌为保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、蝙蝠蛾拟青霉和酵母菌中的至少一种;所述保加利亚乳杆菌的菌株具体可为CICC20244型号，所述嗜热链球菌的菌株具体可为CICC20365型号，所述蝙蝠蛾拟青霉的菌株具体可为CICC14065型号，所述酵母菌的菌株具体可为CICC1211型号，所述嗜酸乳杆菌具体可为CICC6083型号，所述双歧杆菌具体可为CICC21711型号；
[0025]所述酶为糖苷酶、脱氢酶、羟化酶、氧化酶、还原酶、水解酶、转移酶、裂解酶和异构酶中的至少一种；
[0026]所述有机酸为草酰乙酸、草酸、丙二酸、丁二酸、丁烯二酸、酒石酸、苹果酸、柠檬酸、己二酸、苯二甲酸、天冬氨酸、谷氨酸、氨基酸、糖醛酸、甲酸、冰醋酸、乳酸、丙酸、丁酸、戊酸、苯甲酸、水杨酸、磺基水杨酸、苯磺酸、一氟乙酸、二氟乙酸、三氟乙酸、一氯乙酸、二氯乙酸和三氯乙酸中的至少一种；
[0027]所述有机碱为有机胺。
[0028]上述的方法中，所述糖苷酶为葡聚糖苷酶、葡萄糖苷酶或耐高温葡萄糖苷酶；
[0029]所述脱氢酶为NADH脱氢酶或NADPH脱氢酶；
[0030]所述羟化酶为人参皂苷元羟化酶；
[0031 ]所述水解酶为人参皂苷糖基水解酶；
[0032]所述转移酶为人参皂苷糖基转移酶
[0033]所述裂解酶为人参皂苷糖基裂解酶
[0034]所述异构酶为人参皂苷元异构酶；
[0035]所述有机胺为吡啶、莨菪碱、异喹啉和吲哚中的至少一种。
[0036]上述的方法中，所述酶的重量百分比浓度可为0.01?100%;
[0037]所述有机酸的重量百分比浓度可为0.01?100%，具体可为15% ;
[0038]所述有机碱的重量百分比浓度可为0.01?100% ;
[0039 ] 每g所述原料中所述菌的个数可为12?101Qcuf，具体可为I O2Cfu;
[0040]所述每g原料与所述酶的酶活可为1:0.0OlU?108U，具体可为300U;
[0041]所述原料与所述有机酸的质量比可为1:0.01?10，具体可为1:1;
[0042 ] 所述原料与所述有机碱的质量比可为1: 0.0I?1。
[0043]上述的方法中，当采用所述酶催化分解时，所述催化分解的温度可为15?85°C，具体可为37°C，所述催化分解的时间可为4?168h，具体可为24h;
[0044]当采用所述有机酸催化分解时，所述催化分解的温度可为25?95°C，所述催化分解的时间可为2?168h;
[0045]当采用所述有机碱催化分解时，所述催化分解的温度可为25?95°C，所述催化分解的时间可为2?168h;
[0046]上述的方法中，所述催化分解后还包括加热灭活的步骤；
[0047]所述加热的温度可为46?350 °C，具体可为100°C、121°C或100?121°C;
[0048]所述加热的时间可为0.5?24h，具体可为0.5h、2h、5h或0.5?5h;
[0049]所述分离包括萃取和/或柱层析;具体采用萃取将产物中的人参多糖出去，柱层析将所述产物中的人参皂苷分离开。
[0050]上述的方法中，所述柱层析采用的洗脱溶剂为所述乙腈和所述水，所述乙腈和所述水的体积比可为3:1?9，具体可为3: I?9按照梯度进行洗脱；
[0051]所述柱层析采用的洗脱溶剂为所述乙醇和所述水，所述乙醇和所述水的体积比可为1:0.1?I。
[0052]本发明具有以下优点:
[0053]本发明中，原料经催化分解过程时人参皂苷被酶解、释放，并呈现游离状态，脱糖、羟化后形成25位羟化人参皂苷或苷元，通过精细控制催化分解进程，皂苷的产量和组分是可控的。特别是本加工技术能得到较高含量的含25-0H-达玛烷、达玛烯等人参皂苷。
【具体实施方式】
[0054]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0055]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0056]下述实施例中，保加利亚乳杆菌的菌株为CICC20244型号；嗜热链球菌的菌株为CICC20365型号;蝙蝠蛾拟青霉的菌株为CICC14065型号;酵母菌的菌株为CICC1211型号;嗜酸乳杆菌为CICC6083型号;双歧杆菌为CICC21711型号。
[0057]实施例1、
[0058]4年生栽培人参根(紫茎红果人参的晒干参，生晒参5000g，含水5-12%)加入到50L益生菌(每g原料中保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、蝙蝠蛾拟青霉、酵母菌的个数分别为10:^11、10:^11、10:^11、10:^11)催化分解液中，37°(:发酵24小时，100°(:加热30分钟。转化产物经HPLC分析表明，转化率90.3%o主产物为Rg3，Rh2，原人参二醇，原人参三醇，人参二醇，人参三醇，25-0H-达玛烷，25-0H-达玛烯等稀有人参皂苷及苷元及天然人参皂苷。转化人参粉碎，用甲醇回流提取3次，减压除去甲醇后，蒸干。向蒸干物中加入30%的乙醇反复洗涤，去除人参多糖，沉淀物干燥。用甲醇溶解，反相制备柱进行分离(流动相为乙腈和水，1: 3?3:1梯度洗脱)分别获得如下人参皂苷:
[0059]二醇 I组:
[0060]30，120，20(3，10，25-四羟基达玛烷产率3.5%;
[0061 ] 3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-30，120，20(3，10，25-四羟基达玛烷产率4.1%;
[0062]3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-(1—2)-3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-3β，12β，20 (S，R)，25-四羟基达玛烷产率4.5%;
[0063]二醇 II组:
[0064]3β，12β，25-三羟基达玛20(22)烯产率3.3% ；
[0065]3-0-0-0-吡喃葡萄糖基-3队120，25-三羟基达玛20(22)烯产率4.6% ；
[0066]3-0-β-?-吡喃葡萄糖基-(l—2)-3-O-0-D-吡喃葡萄糖基-3β，12β，25-三羟基达玛20(22)烯产率4.7% ；
[0067]二醇 III组:
[0068]20-(S，R)_Rg3 产率 4.8%;
[0069]20-(S，R)-Rh2 产率 5.2%;
[0070]20-(S，R)_PPD产率2.9% ;
[0071]人参二醇产率2.1%;
[0072]二醇 IV 组:
[0073]1^5产率3.6%;1^3产率3.3%;
[0074]二醇 V组:
[0075]天然二醇型皂苷产率6.2%，Rbl产率3.5%，Rb2产率0.5%，Rb3产率0.3%，Rc产率0.5%，Rd产率0.7%，Ral产率0.4%，Ra2产率0.3%，
[0076]三醇I组:
[0077]20_(S，R)_原人参三醇产率2.7%;
[0078]人参三醇产率12%。
[0079]三醇II组:
[0080]20-(S，R)_Rg2产率6.7% ;
[0081 ] 20-(S，R)_Rg6产率7.6% ;
[0082]诎4产率7.3%;