一种条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系及其建立方法和应用
【技术领域】
[0001 ]本发明属于细胞学技术领域，更具体地，本发明涉及一种条件性诱导Cas9表达的 猪滋养层细胞系及其建立方法和应用。
【背景技术】
[0002] 滋养层干细胞（Trophoblastic stem cells，TSCs)和胚胎干细胞（embryonic stem cellS，ESCS)是从哺乳动物早期囊胚建立的两类干细胞，但是两种干细胞具有很大的 差异，TSCs来源于囊胚的滋养层细胞，位于囊胚的外周，体内/体外只能分化为胎盘细胞;而 ESCs则来源于囊胚的内细胞团细胞，在体内可以发育成个体胎儿，而在体外可以无限增殖 和分化成为任何类型细胞的多功能干细胞。
[0003] 在人、大鼠、家兔上，利用BMP4可以将ESCs诱导分化成TSCs。最新研究表明，TSCs也 可诱导分化为类ESCs的多能干细胞，Wu等(2011)利用转染诱导表达0CT4转录因子的方法将 小鼠 TSCs诱导成多能干细胞;这些研究都显示了滋养层细胞在再生医学上的研究价值；同 时滋养层细胞是胎盘形成的干细胞，是研究早期胚胎发育和妊娠机制的重要材料，因此也 举足轻重。
[0004] 然而哺乳动物TSCs的研究起步较晚。哺乳动物TSCs成功建系的报道最早见于1998 年，Tanaka等首次利用条件培养基和FGF4从小鼠囊胚中分离建立了 TSCs，另外，从附植后的 胚外外胚层也能够建立小鼠 TSCs。之后利用类似的方法，建立了小鼠克隆囊胚NT-TSCs和恒 河猴囊胚TSCs等，但是在其他物种上报道还并不多。
[0005] 胎盘是由滋养层细胞分化而建立起来的器官，是胎儿和母体间水分和营养物质等 交换的重要枢纽。水通道蛋白（Aquaporin，AQP)是指一类可以高效选择性转运水分子的细 胞膜通道蛋白，其功能是介导水、甘油、尿素、气体等分子的跨生物膜转运，对调节体内水转 运具有非常重要作用。Zhu等2015证明猪滋养层细胞中大量表达水离子通道蛋白（其中亚型 包括六〇?1^〇?3^〇?4、六〇?5、六〇?6、六〇?7、六〇?9和八〇?11)，和25(1母猪子宫内膜和胎盘内的表 达一致。成为滋养层细胞一个重要生物学特征。
[0006] Tet-on系统因具有极为严密的开/关调控的功能，在制作转基因动物方面得到了 广泛的应用。该系统可以在体外对转入的外源基因进行时间上和组织特异性的调控表达。 在动物的胚胎期，不需要目的基因表达时，添加 Dox会对胎儿的生长和发育带来负面影响。 而Tet-on系统在不添加诱导剂的情况下处于关闭状态，避免了添加诱导剂对胎儿发育的影 响。Tet-on系统对基因的表达进行时间和组织特异性的精确调控，已经被越来越多的科学 家用作制备转基因细胞系或转基因动物的工具。当在细胞模型上研究一些关键基因时，需 要基因破坏时，添加诱导剂，不需要破坏时，停止添加诱导剂，条件性的掌控，防止细胞敲除 以后发生凋亡，因此避免种子细胞枯竭，而丧失种子细胞;对于后期研究具有重要的作用。
[0007] CRISPR-Cas9系统最早在细菌基因组上发现，随后CRISPR-Cas9系统被广发应用于 建立各种动物模型上，成为功能基因组学研究的有力工具。将CRISPR-Cas9系统与Tet-on诱 导表达系统相结合，实现了 CRI SPR-Cas9对各种模型动物和细胞模型进行基因的时空敲除、 敲入及基因修饰作用，真正按照人们意愿及需求建立各种动物模型及探索研究全基因组基 因功能分析提供技术支持。
【发明内容】
[0008] 基于此，为了克服上述现有技术的缺陷，本发明提供了一种条件性诱导Cas9表达 的猪滋养层细胞系及其建立方法和应用。
[0009] 为了实现上述发明目的，本发明采取了以下技术方案：
[0010] 一种条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系的建立方法，包括以下步骤：
[0011] (1)、将Tet-on诱导表达系统与CRISPR_Cas9技术相结合，获得条件性表达的Cas9 基因，将所述条件性表达的Cas9基因进行慢病毒包装，浓缩、纯化，获得滴度为10 8TU/mL的 慢病毒液；
[0012] (2)、在添加有5 · 5~6 · 5yg/mL polybrene的完全培养基中加入80~120yL步骤（1) 的慢病毒液与1〇4个特征的猪滋养层细胞系，孵育5~8小时后换液，每24小时全量换液，2~ 3天后，每lmL培养基中添加 lyg嘌呤霉素(Puro)进行药物筛选，7~8天后得到Tet-on调控 Cas9表达的滋养层细胞系；
[0013] (3)、采用限性稀释法将步骤(2)的滋养层细胞系稀释至单个细胞进行培养25~35 天，经检测得到单个细胞来源的猪滋养层细胞系，即为条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细 胞系。
[0014] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述特征的猪滋养层细胞系来自12d猪胚胎外胚 层分离建立的TSCs，该TSCs在体外稳定增殖，表达多种水离子通道蛋白，具有特征的滋养层 细胞性质，是目前研究猪胎盘发育和妊娠机制的重要材料。
[0015] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述慢病毒与特征的猪滋养层细胞系孵育6小时 后换液，2天后进行药物筛选。
[0016] 在其中一些实施例中，步骤(2)中所述完全培养基为含10%FBS，55yMf3-巯基乙醇， 1 %L_ 谷氨酰胺和 1 %Penicilin_Stretomycin 的 DMEM 培养基。
[0017]在其中一些实施例中，步骤⑶中培养30天。
[0018] 在其中一些实施例中，步骤(3)所述检测为Cas9蛋白表达、Cas9mRNA表达检测、基 因组整合分析以及Tet-on系统分析。
[0019]本发明还提供了上述建立方法建立的条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系。 [0020]本发明还提供了上述条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系在建立特征的基因 编辑细胞系方面的应用。
[0021]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0022] 1)本发明是采用慢病毒技术与CRISPR_Cas9和Tet-on相结合的系统所建立体外条 件性诱导表达Cas9基因的猪滋养层细胞模型，是通过大量筛选后建立的稳转单细胞系，进 行基因组整合、mRNA表达和蛋白表达分析，证明成功建立细胞系；在体外培养时，添加 Dox (强力霉素)诱导，细胞系开始大量表达Cas9,停止添加诱导剂时，Cas9也停止表达，证明获 得了条件性诱导表达Cas9的猪滋养层细胞系；此外，利用猪Sohlhl基因进行验证，在转入 Sohlhl基因靶向的SgRNA以后，添加 Do X诱导时，破坏基因组中Soh 1 h 1基因结构，即细胞系启 动了基因编辑，达到了条件性敲除的目的，进一步说明建立一种有效的细胞系；
[0023] 2)本发明条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系操作简单，使用方便，对于研究 一些滋养层细胞的关键功能基因和猪基因靶点的筛选具有潜在的使用价值，这个细胞系优 势在于条件性表达Cas9，防止细胞敲除以后发生凋亡，而丧失种子细胞，将成为研究猪胎盘 发育的一个重要的细胞材料，可应用于猪早期胎盘发育和子宫妊娠机制的相关研究，同时 对于人类早期胚胎发育的研究也具有很大的参考价值。
【附图说明】
[0024] 图1是本发明实施例1的条件性诱导Cas9表达的猪滋养层细胞系的建立方法的路 线图；
[0025]图2是本发明实施例1的建立条件性诱导Cas9表达的稳转猪滋养层细胞系的过程 图；其中A:条件性Cas9表达的慢病毒穿梭质粒;B:获得了猪滋养层细胞阳性克隆团；C:细胞 扩大培养的结果;D: Cas9基因在细胞基因组整合的检测结果;E: Cas9基因 mRNA表达分析;F: CAS9蛋白表达检测。
[0026]图3是本发明实施例2的CAS9蛋白活性检测图；其中A: SgRNA序列;B: PCR扩增的HU6 启动子(266bp)+SgRNA(85bp)片段;C:Sohlhl基因组编辑的分析结果；
[0027]图4是本发明实施例3中妊娠期不同阶段母猪胎盘AQP1、AQP3、AQP5和AQP9的表达 结果；
[0028]图5是本发明实施例4中AQP1、AQP3、AQP5和AQP9蛋白在妊娠母猪胎盘中的定位结 果;其中，A-B: AQP1蛋白分别在妊娠第25和60天母猪胎盘中的免疫定位;C-D: AQP3蛋白分别 在妊娠第25和60天母猪胎盘中的免疫定位;E-F:AQP5蛋白分别在妊娠第25和60天母猪胎盘 中的免疫定位;G-H:AQP9蛋白分别在妊娠第25和60天母猪胎盘中的免疫定位;I:兔IgG作为 阴性对照。
[0029] 图6是本发明实施例5中猪滋养层细胞系水离子通道蛋白亚型的免疫荧光检测结 果，其中A、D、H、K、N分别为4〇?1^〇?3^〇?5^〇?9和兔以6染色 ;83、1、1^、0均为04?1染色;(：、 F、J、Μ和P分别为AQP1、AQP3、AQP5、AQP9和兔I gG与其DAP I染色的叠加图。
【具体实施方式】
[0030] 下面结合附图和具体实施例来对本发明作进一步说明。