染目前中国流行口蹄 疫病毒动物的抗血清，自然未感染的猪血清自己制备，感染A10、01-BFS的猪血清、牛血清、 羊血清用现行生产攻击毒制备，灭活纯化的标记口蹄疫疫苗自备。
[0038] 大肠杆菌抑制菌株TGl，非抑制菌株TOPlOF购自美国Invitrogen公司。大肠杆菌抑 制性菌株JM109、大肠杆菌抑制性菌株化I-Blue购自美国STRATAGE肥公司。辅助隧菌体 M13K07、抗M13辣根过氧化物酶禪合物购自美国GE公司。96孔板购自丹麦Nunc公司。S乙胺 购自Sigma公司。Benzonaze酶购自Novagen公司。
[0039] 1.2抗原的制备
[0040] WFMDV 0/China/99(Genbank NO.AF506822)的序列为模板，设计3ABC基因扩增引 物：3ABC-BamF AGT CGG ATC CCC AAT TCC TTC CCA AAA ATCT，3ABC-HinR AGC TAA GCT TAG TGG TGT GGT TCG GGG TCA A。扩增产物用BamHI、Hind III酶切后，克隆于相同酶切的 质粒pGEM-T制备得到pGEM-3ABC，3ABC基因 2端分别含酶切位点BamHI和Hind III。全长3ABC 基因 （nt 4988-6298nt)用Kpn I、HindIII酶切克隆于相同酶切的质粒pRSETb(购自 Invi trogen公司）中进行表达。表达3A、3B、3C的质粒用PCR方法，WpGEM-3ABC为模板亚克隆 到pRSE化质粒中，所有构建的表达质粒测序确认，表达质粒分别转化大肠杆化21 (DE3K购 自Novagen公司）。用含50iig/ml氨节青霉素的LB培养基37°C摇荡过夜培养，1:100稀释37°C 培养化，加入IPTG使其终浓度ImM，37 °C培养4h后，10，000 X g离屯、5分钟，沉淀用溶解缓冲液 (SOOmM化Cl，50mM憐酸缓冲液，pH 7.8)重悬，进行超声。10，000 X g离屯、20min获得不溶性 的包涵体，用PBS配制的8M尿素溶解包涵体，室溫下使用制备型SDS-PAGE电泳16小时分离获 得重组3ABC蛋白。其他口蹄疫病毒的非结构蛋白都用此法获得，表达为不溶性包涵体，用 SDS-PAGE和免疫印迹确定其纯度95%，免疫印迹显示r-3ABC分子量为55kDa。
[0041] 1.3猪的免疫
[0042] 2只15日龄仔猪，经检验无猪口蹄疫病毒抗体、无其他猪病毒抗体，每只皮内注射4 剂含上述获得抗原的乳化疫苗200微升（100微升3ABC和100微升Montanide ISA201佐剂混 合乳化，购自法国SEPPIC公司，含r-3ABC 100微克/剂），第一剂后14天注射第二剂，21天后 注射第S剂，完成3剂免疫后14天，用含100微克纯化3ABC蛋白的乳化疫苗200微升肌肉加强 免疫一次，猪麻醉取脾脏分离淋己细胞。每次免疫前取血用免疫印迹分析抗体有无。
[0043] 1.4猪3ABC抗体RNA和互补DNA制备
[0044] 收集的猪脾脏加入冷PBS研磨均匀后，加到等体积的化stopaque-1077(购自美国 Sigma公司），700 Xg离屯、20分钟分离获得白细胞，用试剂盒(RNeasy midi kit,购自Qiagen 公司）提取总RNA。互补DNA(cDNA)用试剂盒（Qiagen Omniscript cDNA synthesis kit,购 自Qiagen公司）制备，用随机6核巧酸引物法合成，每100微升反应需要30微克引物。
[0045] 1.5PCR扩增重链和轻链可变区片段基因
[0046] 设计抗体基因引物如表1，100微升反应体系包括：1化1模板CDNA，5化12 X^tstar 混合液(购自Qiagen公司），正反向引物各化l(6ng)n95°C变性15分钟，进行35个循环，每个 循环包括94°C变性45秒、50°C退火2分钟、72^延伸2分钟，循环完成后72°C延伸10分钟。
[0047] VH和化扩增反应各进行15次并各自合并，经1.2%琼脂糖凝胶电泳分离、试剂盒 (QIAquickgel extraction kit，Qiagen)纯化，VL片段约为350bp，VH约为390bp。
[004引表1.重组抗体库构建、测序引物
[00491
[0050] 1.6抗体基因文库构建
[0化1] Phagemid pCANTAB-link质粒和纯化化基因片段用SaU和NotI限制性酶消化，连 接酶连接形成pCANTAB-1 ink-VL临时文库，转化大肠杆菌化-化Iue细胞。纯化的VH基因片段 用Asc I和Xba r消化，克隆至IjpCANTAB-Iink-VL的Asc I和Xba I限制性酶切位点之间的区 域形成完全文库pCANTAB-VH-link-VL，电转染大肠杆菌化-Iblue细胞，取样涂于含100微 克/毫升、2 %薦糖的SOBAG琼脂板，检测文库的大小，其余涂于60个SOBAG琼脂板，置于30°C 过夜。每个板菌落刮下来装入5ml 2YT培养基，加入1毫升含6Xl〇w隧斑形成单位的感染辅 助隧菌体M13K07，37°C震荡培养2小时，1400 X g离屯、15分钟，用10毫升含100微克/毫升、50 微克卡那霉素/毫升的2YT-AK培养液重悬，37°C震荡培养过夜，1400 X g离屯、20分钟分离沉 淀获得上清。上清用0.45曲1过滤、PEG沉淀，获得含隧菌体颗粒上清。
[0化2] 1.7抗体文库筛选
[0053] 96孔板的24孔用含50纳克纯化的FMDV完整r-3ABC蛋白的碳酸钢缓冲液(P朋.5)4 毫升包被过夜，每孔加入200微升含0.1 %Tween 20憐酸钢(PBS-T)洗涂S次，用150微升含 5 %脱脂牛奶的PBS-T室溫封闭2小时。按3:1比例用300微升封闭液稀释100微升PEG沉淀后 的隧菌体，每孔加入400微升稀释的隧菌体，室溫解育2小时，用PBS洗涂S次后再用PBS-T洗 涂S次，加入100微升IOOmMS乙胺室溫解育15分钟，洗脱隧菌体，用50微升化is-HCl (含 1.5 %牛血清白蛋白，pH 7.4)中和S乙胺。隧菌体库的大小包括1011个克隆，加入大肠杆菌 TG137 °C解育1小时，使隧菌体感染TGl细胞，感染后的细胞分散到LBGC板上（1 %酪氨酸蛋白 腺、0.5 %酵母提取物、1 %氯化钢、ImM氨氧化钢、2 %薦糖、50蛇/血簇节青霉素，LBGC)，25 °C 培养2天直到形成克隆，收集合并所有克隆保存在SBS培养基中（3 %络氨酸蛋白腺、2 %酵母 提取物、0.5%氯化钢、20mM his-HCLpH)，补加 15%甘油-80°C保存备用。
[0054] 上述第一轮筛选的感染隧菌体的大肠杆菌500微升加到含50yg/mL簇节青霉素的 培养基中（SBSC)，37°C培养2小时，与8.8 X l〇iDp化感染辅助隧菌体M13K07，37°C培养1小时。 为选择双重感染能生产单链抗体的大肠杆菌，细菌液按10化g/mL加入氯霉素，按50iig/mL加 入卡那霉素，25°C培养2天，离屯、细菌后上清用0.45皿滤器过滤，用4%阳G/0.5M化Cl溶液 沉淀，用1.5%BSA、0.2%Tween20的TBS重悬，加入Benzonaze酶消化不需要的DNA。按W上 步骤反复进行4次筛选，逐步增加洗涂次数10次、20次、30次，并减少包被的3ABC量。
[0055] 1.別蘆菌体表面展现抗体的筛选和表达
[0化6] 感染隧菌体、对数生长期细菌E. COli化I-Blue涂于LBGC板，25°C培养2天形成克 隆。挑选每个克隆接种96孔板(含2%薦糖SBSC培养液150微升），25°C震荡培养过夜，摇速 25化pm，取4微升转入40微升含2X108P即M13K07隧菌体的LBGC，细菌液按10化g/mL加入氯 霉素，按50iig/mL加入卡那霉素，25 °C培养2天，细菌液(获得隧菌体克隆）1500 X g离屯、20分 钟取细菌沉淀重悬于400微升LBGC，离屯、后上清液含隧菌体。取50微升用间接化ISA检测。细 菌沉淀中化agemid DNA用试剂盒（QIAprep Miniprep Kit Qiagen)制备。
[0057] 1.9隧菌体可溶性单链抗体制备和检测
[005引大肠杆菌TOPlOF'-FS，属于非抑制菌株，携奇霉素抗性基因，用隧菌体感染，用含 50yg/mL奇霉素的平板选择(LBGCS)，PCR反应检测确认SCFv基因阳性克隆，挑选阳性克隆接 种于5毫升2 X YT培养液(含50iig/mL簇节青霉素、5化g/mL奇霉素、1 %薦糖）在25°C培养过 夜，加入新鲜配制的40毫升2 X YTCS在30°C培养1小时，加入ImM IPTG在30°C诱导化，收集细 菌破碎后进行化ISA检测。
[0化9] ELISA筛选鉴别的阳性克隆隧菌体电转染大肠杆菌非抑制菌株TOPIOF'-FS，每个 克隆接种到50毫升2YT-AG培养液中，30°C培养过夜，取16毫升，加入400毫升新鲜2YT-AG培 养液（1/25稀释)30°C震荡培养1小时，细胞离屯、后重悬于含ImM IPTG新鲜的400毫升2YT培 养液，30°C培养4小时诱导可溶性完整3ABC单链抗体scFVs表达。1400 X g离屯、20分钟收集菌 体，重悬于25毫升PBS，用法国式压力法和细菌裂解液溶解细菌，SOOOXg离屯、30分钟除去细 菌碎片获得抗体溶液。
[0060] 1. IOPCR和DNA测序筛选SCFv插入隧菌体的克隆（检巧巧法）
[0061 ] 直接用克隆抗体链的引物对scFVs阳性克隆隧菌体DNA进行PCR扩增，序列采用每 个含插入单链抗体隧菌体化I-Blue克隆进行PCR反应，
[0062] 正向引物：Cm-f: 5 ' -TGTGATGGCTTCCATGTCGGCAGAATGCT-3 '，
[0063] 反向引物的-r: 5 '-GCTAAACAACTTTCAACAGTCTATGCGGCAC-3 '），
[0064] 反应体系30微升，首先94°C预变性2分钟，进行35个循环扩增，每次循环94°C变性 20秒，53 °C退火20秒，68 °C延伸1分钟，反应产物经1 %琼脂糖电泳纯