化、测序确证SCFv基因 序列和插入方向正确。SeqMan、MegAlign程序(DNA Star公司）分析。
[0065] 1.11.蛋白免疫迎迹分析
[0066] 12 % SDS-PAGE分析后，蛋白在缓冲液(CAPS，pHl0.5，0.5 %w/vDTT，15 % v/v 甲醇）， 65V电压下转染到PVDF膜，（购自密理博公司，0.45微米）dPVDF膜预先用缓冲液（CAPS, pHlO . 5，0.5 % w/vDTT，15 % v/v 甲醇）浸润，PVDF膜用含0.05 % Tween超级封闭液 (Superblock PBS，购自美国Pierce)封闭，在室溫作用1小时或4°C过夜，用含0.05%吐溫的 PBST洗涂3次，每次10分钟，用亲和层析纯化的3ABC多克隆抗体（1:5000稀释)室溫解育1小 时，用PBST洗涂S次，用1:100000羊抗兔辣根过氧化物酶IgG，（购自美国Sigma公司）室溫解 育1小时，用E化(购自美国PI邸CE)显色。
[0067] 1.12.可溶性3ABC单链抗体scFVs性质和检测方法
[006引96孔化ISA板孔包被100微升含0.25微克FMDV-3ABC蛋白的碳酸钢缓冲液（pH 9.6 )，4°C过夜，加入100微升5 %脱脂牛奶的PBS-T室溫封闭1小时，隧菌体结合可溶性完整 3ABC单链抗体SCFV或可溶性完整3ABC单链抗体溶液用封闭液按1:5稀释，加入1; 10000稀释 的鼠抗E标签的HRP单克隆抗体(购自GE公司）100微升，用TMB溶液显色，2M硫酸溶液终止反 应，405nm测定吸收值。非特异性检测采用同样步骤和条件，但选用同一系统表达的其他蛋 白作为阴性对照。
[0069] 1.13竞争化ISA检测口蹄疫病毒非结构蛋白建立
[0070] 优化包被液含口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC(自行裂解）、3B、3ABC抗原按常规方法 包被，不同检测的血清用封闭液稀释后，每孔加入30微升，37°C解化30分钟并不断摇动，加 入30微升PRAb-scFv-3B2(1:1000稀释)或PRAb-FM27(1:2000稀释），37°C解化60分钟并不断 摇动，用洗液PBS-T洗涂S次，加入1:10000辣根过氧化物酶标记的兔抗3ABC单链抗体的IgG 抗体100微升，用TMB溶液显色，2M硫酸溶液终止反应，405nm测定吸收值。每个检测血清用复 孔，设有除检测血清的所有试剂对照W检测最大光密度。阻抑百分率(PI) = l〇〇-(待检测血 清或样本OD/(最大OD) X 100。
[0071] 2、结果
[0072] 2.13ABC特异性隧菌体单链抗体克隆和特性
[0073] W纯化的重组3ABC作为抗原经过4轮筛选获得1〇11独立克隆，用化ISA对419个克隆 筛选，23%为阳性克隆，S/N〉2。用PCR对23个阳性克隆扩增ScFv基因并推断氨基酸序列，有3 个克隆，标记为PRAb-scFv-2Al、PRAb-scFv-3B2、PRAb-scFv-4Hl，4H1 基因型独特，3个克隆 重链可变区和轻链可变区序列分析显示，3B2JA1的VH框架区（FR)非常相似，有3个氨基酸 的不同，互补决定簇区（CDR)相同，化框架区FR有9个氨基酸不同、CDR有9个氨基酸不同，结 果如下表2所所示。20个克隆VH和化测序推断其氨基酸序列显示来自不同来源的克隆。辅助 隧菌体M13K07为阴性对照并无结合后的信号。说明隧菌体抗体亲和性不是隧菌体本身所 带。
[0074] 3B2从重链FR 1到FR4、连接子、到轻链FR 1到FR4的氨基酸序列如下所示： Raviidesggglqtpggalslvckasgfifssydmawvrqapskgleyvasissggsftyygaavkggrtiis畑NG QSTV 化化 NNLRAEDAGTFYCAKAADSDYAWSAD …DAWG 服 TEVIVS 化 DGGGGSGGGGSGGGGSTALTQPSSVSA NPGETNKITCSGGGSYYCWYQQKSPGSAPVTVIYWDDERPSGIPSRFSG沈SGSTATLTITGVRAEDEAVYYCGSWE DSSSTAIFGAGTTLTVLGAA(SEQ ID N0.1 所示）。
[0075] 表2.隧菌体表面展示的3ABC单链抗体2A1W及4H1与3B2氨基酸序列的不同
[00761
[0077」 2.2scFv克隆的免巧表位分化
[007引为检测获得的S种克隆是否结合3ABC蛋白的不同区域，使用重组的3A、3B、3C和 3ABC蛋白进行免疫印迹分析，结果表明3个抗体克隆2A1、3B2、4H1都能识别3ABC、3C，但不识 别3A和3B蛋白W及不相关蛋白（阴性对照），表明3个隧菌体显示的单链抗体结合包含3C的 表位。
[0079] 2.3竞争ELISA检测口蹄疫病毒非结构蛋白建立
[0080] 为评估3个隧菌体单链抗体对血清抗体的阻抑率，用猪感染FMDV不同时期的4份血 清(FMDV血清型:01-Manisa、Asial-中国江苏猪、A22-中国、C-OberbayernJ份备存猪血清 (0型和Asial型血清混合、0型和A型混合血清)进行竞争化ISA，首先血清稀释10倍，倍比稀 释至 1:1280。
[0081 ] 在优化的化ISA条件下，3ABC和3C包被抗原可区分10倍稀释的血清。3B2对FMDV阳 性血清、包被348(：抗原的化154的阻抑百分比为85-91%，包被3讨亢原，阻抑百分比为69-88% ;包被3ABC抗原，3B2对阴性血清的阻抑百分比为21-26%，包被3C抗原，3B2对阴性血清 的阻抑百分比为34-41 % JRAb-SAl在竞争化ISA中，包被ABC抗原，对阳性血清的阻抑百分 比为65-83%对阴性血清的阻抑百分比为31-37%，包被3C对阳性血清的阻抑百分比为37-45%，对阴性血清阻抑百分比为19-30%。因此说明PRAb-3B2作为检测抗体和3ABC作为包被 抗原能够明显区分阳性和阴性血清(图1和图2)。
[0082] 实施例23B2重组单链抗体可区别FMDV感染与免疫动物
[0083] 选用猪、牛、羊FMDV阴性血清、FMDV感染血清、FMDV疫苗免疫血清，其中牛血清18 份，阳性、阴性、疫苗免疫血清各6份，15份羊血清包括3份阳性血清、6份未感染阴性血清、6 份免疫血清，猪血清16份包括6份阳性血清、4份未感染自然血清、6份疫苗免疫血清。采用 3B2重组单链抗体作为检测抗体，W3ABC作为包被抗原进行竞争化ISA反应(方法同实施例 1)，检测结果表明：3B2重组单链抗体对牛的6份阴性血清、6份疫苗免疫血清无阻抑。6份阳 性猪血清型分别为Ol-ManisaX-Oberbayern、Asial-中国、3个A型血清：Al5、A22-Iraq、 A24-化uzeiro,阻抑率大于90%。牛0型血清:6个未感染、6个疫苗免疫血清的阻抑百分比小 于15%，对阳性血清(A24型）的阻抑百分比介于52-80%。测定羊血清中，测定疫苗免疫和感 染的区别没有猪和牛明显，对感染阳性血清的阻抑百分比介于60-80%，对疫苗免疫血清的 阻抑百分比介于2-30%，对未感染血清的阻抑百分比小于18%。
【主权项】
1. 猪源口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单链抗体，命名为PRAb-SCFv-3B2，其特征在于所 述单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。2. 编码权利要求1所述的单链抗体的核苷酸序列。3. 权利要求1所述的单链抗体在制备检测口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC或3C蛋白试剂中 的用途。4. 如权利要求3所述的用途，其特征在于所述的试剂用于区分口蹄疫病毒自然感染动 物以及口蹄疫疫苗免疫动物。5. -种用于区分口蹄疫病毒自然感染动物以及口蹄疫疫苗免疫动物的口蹄疫病毒 3ABC抗体竞争ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括包被口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的酶标 板以及权利要求1所述的单链抗体PRAb-s cFv-3B2。6. 如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、封 闭液、显色液、洗涤液。7. 如权利要求5或6所述的试剂盒，其特征在于用于区分口蹄疫病毒自然感染动物以及 口蹄疫疫苗免疫动物时，按照以下方法进行： (1) 取出包被口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的酶标板，以洗涤液洗板； (2) 向酶标板中加入封闭液稀释的待测动物血清，37°C孵育30分钟，并不断摇动，加入 权利要求1所述的单链抗体PRAb-ScFv-3B2，37°C孵化60分钟并不断摇动，以洗涤液洗板；同 时加入阴性血清和阳性血清作对照； (3) 然后加入辣根过氧化物酶标记的兔抗3ABC单链抗体的I gG抗体； (4) 向加酶标记抗体后的酶标板中加入TMB溶液，振荡混合后37 °C显色，2M硫酸溶液终 止反应； (5) 检测在0D··处的吸光值A450nm 〇8. 根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性对照为未感染口蹄疫病毒 也未接种口蹄疫疫苗的阴性血清；阳性对照为口蹄疫病毒阳性血清;所述封闭液为含有1 % 牛血清白蛋白的PBST缓冲液;所述洗涤液为PBST缓冲液。9. 权利要求5-8任一项所述的试剂盒在在制备区分口蹄疫病毒自然感染动物以及口蹄 疫疫苗免疫动物试剂中的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种猪源口蹄疫病毒非结构蛋白3ABC的单链抗体及其制备方法和用途。本发明通过口蹄疫病毒重组非结构蛋白3ABC免疫猪，建立了重组单链可变区抗体文库，并从中筛选获得了口蹄疫病毒重组3ABC单链抗体噬菌体克隆。将重组3ABC单链抗体在大肠杆菌中表达后，用竞争ELISA法检测自然未感染、FMDV疫苗免疫以及FMDV感染的动物血清，表明该单链抗体在区分FMDV感染和免疫动物方面具有良好的特异性和灵敏性，可作为各型口蹄疫病毒、各种口蹄疫易感动物DIVA的高效检测工具。
【IPC分类】C12N15/13, C07K16/10, G01N33/569
【公开号】CN105693853
【申请号】CN201610025332
【发明人】张澍, 吕宏亮
【申请人】北京健翔和牧生物科技有限公司, 吕宏亮, 张澍
【公开日】2016年6月22日
【申请日】2016年1月14日