一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分及其制备方法
【专利摘要】本发明提供了一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分及其制备方法，其以疏血通注射液为原料，经进一步分离、精制而得到，所述的寡糖类组分主要是由大约2～10个左右单糖单元聚合而成的一系列寡糖组分，其分子量范围为200Da～3000Da，对体外ADP诱导和胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。通过本发明提供的技术方案，获得的具有潜在抗血小板聚集活性的寡糖类组分，其分子量大小适中，也可以作为一种潜在的前体物质，进一步通过化学修饰或改造而增强活性，从而开发制成应用于心脑血管疾病领域的抗血小板治疗药物。
【专利说明】
一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种活性寡糖类化合物组分及其制备，具体指一种具有抗血小板聚集 活性的寡糖类组分及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 血栓疾病严重威胁着人类的健康，血栓形成或栓塞是导致心、脑和外周血管事件 的最后关键环节，是致死和致残的直接原因。在血栓以及动脉粥样硬化的形成等过程中，血 小板起着重要的作用。因此，在血栓性疾病中抗血小板治疗占有十分重要地位。
[0003] 随着近年来中药大品种二次开发及对中药物质基础认识的不断深入，多糖或低聚 糖类成分作为生物体内重要生理活性物质日益受到重视，其不仅具有构成组织、储存能量 的功能，而且对肿瘤、肝炎、心血管、抗衰老、免疫促进和抗感染等多方面具有独特的生物活 性，且细胞毒性低。丁冠华等对市售地龙药材中的多糖类成分进行了测定(丁冠华.水蛭、地 龙药材商品中总多糖含量测定.中华中医药学报[J]，2010，28(5): 986-987)，以此来评价两 种市售药材的品质，也从侧面反应了多糖(寡糖)类成分的重要性。
[0004] 疏血通注射液是由水蛭、地龙提取并精制而成的中药注射剂。具有活血化瘀、通经 活络之功效，主要用于瘀血阻络所致的脑梗塞急性期，能有效的改善因脑缺血所引发的口 眼歪斜、半身不遂、语言謇涩等症状。以往的研究也已经证实疏血通注射液主要含有次黄嘌 呤、氨基酸、多肽、多糖(主要是寡糖或糖肽)等成分。鉴于寡糖成分在生命体及治疗疾病中 的重要作用，进一步揭示其中的活性组分及其作用机制尤为重要，为更好的为临床治疗提 供服务和治疗依据，特将疏血通中的寡糖进行分离、纯化，经进一步深入研究后，明确其具 体组成，并进行活性确证。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的主要是提供一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分及其制备方 法。这种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分是以疏血通注射液为原料，经进一步分离、精 制而得到。疏血通属于纯动物类中药注射剂，经多年研究，大类成分物质基础基本明确，但 获得具有活性的寡糖类组分并进一步的分离、纯化、鉴定属于行业内的重大突破。本发明对 于所获得的寡糖类成分的经PMP衍生化法测定活性寡糖组分中的单糖组成，确认所述的寡 糖类组分中单糖单元为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要为葡萄糖。经LC-MS分析，确认所 述的寡糖组分主要是由大约2~10个左右单糖单元聚合而成，其分子量范围为200Da~ 3000Da，其中主要集中在200Da~2000Da。通过血小板聚集试验，确认所述的寡糖组分抗血 小板聚集活性主要是对体外ADP诱导和胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。
[0006] 以上所述的寡糖类组分通过如下步骤制备而得：
[0007] a.前处理：取疏血通注射液减压浓缩至一定体积，其中减压浓缩温度为40°C~70 °C，其中优选50°C，减压浓缩的最终体积为浓缩前体积的1/2~1/4，其中优选最终体积为浓 缩前体积的1/3。
[0008] b.醇沉:取浓缩液，加入一定量乙醇醇沉，其中优选加入乙醇后最终含醇量为70 % ~80%，低温静置，弃去上层含乙醇液体，取沉淀层。
[0009] c.柱层析:取沉淀层加适量水溶解后，离心，取上清液通过分子筛排阻的凝胶过滤 柱，主要是指葡聚糖凝胶柱，其中，所述的凝胶柱为Sephadex G15、Sephadex G25、Sephadex G50或类似填料的类似型号;所述凝胶柱的洗脱溶剂为水，洗脱液收集体积为1/3~1的柱体 积，其中优选1 /2柱体积。减压浓缩后，再通过预先活化的阴离子交换柱，收集洗脱液，其中， 所述阴离子交换柱为DEAE-52或类似填料，所述阴离子交换柱，主要是指弱阴离子交换柱， 所述阴离子交换柱的洗脱溶剂为水，洗脱液收集体积为1~3柱体积，其中优选2柱体积，最 后经浓缩，冻干即得。
[0010]通过本发明提供的技术方案，获得的具有潜在抗血小板聚集活性的寡糖类组分， 其分子量大小适中，也可以作为一种潜在的前体物质，进一步通过化学修饰或改造而增强 活性，从而开发制成应用于心脑血管疾病领域的抗血小板治疗药物。其也解决了目前中药 领域尤其是动物类中药注射剂普遍存在的一些问题，比如中成药临床定位宽泛、药效物质 不清、作用机制不明的共性问题。此外，本发明所提供的活性寡糖类组分，不仅可能为本领 域临床治疗用药提供一种更多的选择，同时对于其他同类产品进一步掌握糖类物质基础提 供了方法和途径。
【附图说明】
[0011] 图1甘露糖、葡萄糖、半乳糖对照品高效液相色谱图
[0012] 图2活性寡糖组分未水解样品的高效液相色谱图
[0013] 图3活性寡糖组分水解样品的高效液相色谱图
[0014] 图4活性寡糖组分LC-MS鉴定图谱
【具体实施方式】
[0015] 下面结合实施例和附图对本发明进一步说明，所述实施例仅用于对本发明阐述示 例，所述方法并不构成对本发明权利要求的限制。
[0016] -、寡糖类组分的制备
[0017] (1)前处理:取疏血通注射液1L，减压浓缩，温度60°C，浓缩至约300ml。
[0018] (2)醇沉:取浓缩液缓慢加入1.2L乙醇（约4倍量），不断搅拌，静置过夜，弃去上层 含乙醇液体，取沉淀层约15g (湿重）。
[00?9] ⑶柱层析:取沉淀层，加入约250ml水充分搅拌、溶解，4500rpm离心10min，取上清 液通过Sephadex G15葡聚糖凝胶柱（8cm* 100cm)，用水洗脱，收集1/2柱体积洗脱液约 2500ml，减压浓缩后，再通过预先活化的DEAE-52阴离子交换柱(5cm*80cm)，用水洗脱，收集 2柱体积洗脱液约3000ml，浓缩，冻干即得白色疏松干燥物约2g(寡糖组分提取物）。
[0020]二、PMP衍生化法测定活性寡糖组分中的单糖组成 [0021] 1仪器和实验材料
[0022] 1.1仪器
[0023] Agilent 1260高效液相色谱仪，配备四元梯度栗、自动进样器、柱温箱、紫外检测 器；高速离心机，Sigma公司产品；METTLER T0LED0XP205电子天平；旋转蒸发仪SB-2000型 (上海爱朗仪器有限公司）;KQ5200DB型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司）。
[0024] 1.2实验材料
[0025] 三氟醋酸（TFA)购于TED IA公司，色谱级；1 -苯基-3 -甲基5-吡唑啉酮(PMP)，分析 纯，购于天津市大茂化学试剂厂;氯仿，购于美国MREDA TECHNOLOGY公司，色谱级;NaOH，HCI 均为分析纯，购于北京化工厂;磷酸二氢钾，分析纯，购于国药集团化学试剂有限公司；甲醇 及乙腈购于美国Honeywell Burdick&Jackson公司，色谱级;水，去离子水;糖对照品D-甘露 糖(Man)、D-无水葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)均购于中检院，Man批号：140651-200602，Glc批 号：110833-200904，Gal批号：100226-200404;寡糖提取物，自制。
[0026] 2实验方法
[0027] 2.1分析条件和系统适用性实验
[0028] Phenomenex C18(4 · 6 X 250mm，5μηι);流速：1 · 2ml/min;流动相：20mmol/L醋酸铵 (A)-乙腈(B);采用梯度洗脱，洗脱程序如下:0-2511^11上85%-72.5%，8:15%-27.5% ;25-30min，A: 72 · 5 %-60%，B: 27 · 5%-40 % ;柱温为25°C ;进样量:5yL;检测波长:245nm。理论塔 板数以葡萄糖峰计算，不低于3000,各单糖色谱峰与最近的色谱峰的分离度和拖尾因子均 符合2010版中国药典相关规定。
[0029] 2.2溶液及对照品配制
[0030] 12.5%的磷酸盐缓冲液配制:精密称取12.5g磷酸二氢钾，置于100mL容量瓶中，加 水溶解，并稀释定容至刻度，即得。
[0031] 0.5mol/L PMP甲醇溶液的配制：精密称取PMP 0.5g，置于5ml容量瓶中，加甲醇使 溶解并定容至刻度，摇匀即得。
[0032] 0.3mol/L NaOH溶液的配制：精密称取固体NaOH 0.12g，加适量水溶解后，转移至 l〇ml容量瓶中，加水稀释并定容至刻度，摇匀即得，转入塑料离心管中待用。
[0033] 0.3mol/L HC1溶液的配制：精密吸取12N HC1 0.25ml，置于10ml容量瓶中，加水稀 释并定容至刻度，摇匀即得。
[0034]混合对照品的配置:精密称取4mg甘露糖对照品，2.5mg半乳糖对照品，分别置于 l〇mL容量瓶中，加水溶解，稀释并定容至刻度。精密称取5mg葡萄糖对照品，置于10mL容量瓶 中，加入lmL半乳糖对照品溶液和lmL甘露糖对照品溶液，再加入适量水溶解，加水稀释并定 容至刻度，即得到混合对照品溶液，溶液中各对照品的浓度为：葡萄糖2mg/mL，半乳糖 0 · lmg/mL，甘露糖0 · 2mg/mL。
[0035] 0.4mg/mL寡糖待测样品的配置:精密称取10mg寡糖样品置于25mL容量瓶中，加水 溶解，稀释并定容至刻度，即得寡糖供试品溶液。
[0036] 2.3寡糖的水解及衍生化反应
[0037]寡糖水解：精密吸取lmL浓度为0.4mg/mL的寡糖待测样品，置于5mL安瓿中，加入 6%的TFA溶液2mL，充氩气后封口（充气15s)，110°C水解3h，将反应后的溶液转入鸡心瓶中， 在旋转蒸发仪上，60°C减压蒸至无 TFA味，加入lmL水溶解残渣，即得多糖水解液。
[0038] PMP衍生化反应：精密量取100yL多糖水解液，置于10mL塑料离心管中，加入 0.3mol/LNa0H溶液 100yL和0.5mol/L PMP甲醇溶液200yL，用0.3mol/L NaOH溶液将pH调至 7.2至8.5之间；涡旋混匀，于70°C水浴反应45min，冷却至室温后，加入与上述0.3mol/L NaOH溶液使用量相当的0.3mol/L HCI溶液，涡旋混匀；加入12.5%的磷酸盐缓冲液，稀释反 应溶液至1. OmL，祸旋混勾后，加入5mL氯仿，祸旋30s，4500rpm离心5min，取上层水层， lOOOOrpm高速离心5min，取上清液，即得糖水解衍生化后供试品溶液，进行HPLC检测，同时 进样未水解衍生化样品。
[0039] 3.实验结果
[0040]实验结果表明，所制备寡糖的主要单糖种类为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要 为葡萄糖，结果见附图1~附图3。
[0041 ]三、寡糖类组分的LC-MS分析 [0042] 1仪器与实验材料
[0043] 仪器：UHPLC:Agilent 1290:MS:Agilent 6540 Q-T0F;
[0044] 试药:水为超纯水；乙腈Honeywell Burdick&Jackson公司，色谱级；甲酸(LC-MS 用）；寡糖提取物，自制。
[0045] 2分析条件
[0046] 色谱条件:采用C18短柱(2 · l*50mm，1 · 8μπι)。
[0047] 流速采用 0.1ml/min。
[0048] 流动相:A:水(含0.1%FA) B:乙腈(含0.1%FA)。
[0049] 梯度条件如表1:
[0050]表1:梯度条件
[0052]质谱条件:正离子模式。
[0053] Gas temp：350〇C ；Drying Gas：lOL/min；Nebulizer：35psig；fragmentor：175V； Vcap:4000V;Collision Energy:25〇
[0054] 取少量寡糖用超纯水溶解过滤后，进样分析。
[0055] 3实验结果
[0056] LC-MS分析结果表明，所述寡糖类组分为中性寡糖(M+Na峰），主要是二糖~十二 糖，分子量范围为200Da~3000Da，其中主要集中在200Da~2000Da。分析鉴定结果见附图4。 [0057]四、寡糖对血小板聚集试验 [0058] 1试验材料
[0059] (1)药物:寡糖，现用现配，临用前用生理盐水配制成20mg/mL母液。阳性药物，替格 瑞洛原料药和阿司匹林原料药，用无水乙醇配制成l〇〇ymol/L和5mmol/L母液，生理盐水稀 释至所需终浓度。
[0060] (2)动物：SD大鼠，清洁级，雄性，体重220-250g，由北京华阜康生物科技股份有限 公司提供，生产质量合格证号:SCXK(京)2014-0004。
[0061 ] (3)试剂：二磷酸腺苷钠盐（adenosine-5-diphosphate，ADP)，美国Sigma公司生 产，国内分装，500mg/瓶;胶原(Collagen from rat tail)，美国Sigma公司生产，国内分装， 50mg/瓶;氯化钠注射液，四川科伦药业股份有限公司，批号：20151004;二水合梓檬酸钠，分 析纯，西陇化工股份有限公司，批号：150715。
[0062] (4)实验仪器
[0063] SC-2000血小板聚集测试仪，北京赛科希德科技发展有限公司；
[0064] YP3001N电子天平，上海精密科学仪器有限公司；
[0065] 2实验方法
[0066]选用成年健康SD大鼠，雄性，适应环境后，腹主动脉采血，以3.8%枸橼酸钠与血液 1:9的比例抗凝，然后以110g/min离心10min，制备富血小板血衆(platelet rich plasma， PRP)，剩余部分以1100g/min离心10min制备贫血小板血楽_(platelet poor plasma，PPP)， 以PPP调零，用PPP调整PRP的血小板计数为400X 109/L，与药物或生理盐水37°C孵育30min， 然后加入ADP(终浓度为5μΜ/1)或胶原（终浓度为30yg/mL)诱导聚集。用血小板聚集仪检测 血小板最大聚集率，按下列公式计算血小板聚集抑制率(AIR):
[0067] AIR=[(空白对照组最大聚集率一给药组最大聚集率)/空白对照组最大聚集]* 100%
[0068] 3试验结果和评价
[0069] 结果见表2和表3。
[0070]表2寡糖对体外ADP诱导血小板聚集的影响（[士s)
[0072] 注:与生理盐水比较，*表示P<0 · 05，**表示P<0 · 01，***表示P<0 · 001。
[0073] 表3寡糖对体外胶原诱导血小板聚集的影响（i ±s)
[0075] 注:与生理盐水比较，*表示P<0 · 05，**表示P<0 · 01，***表示P<0 · 001。
[0076] 通过研究发现:寡糖终浓度为1.33~4mg/mL对体外ADP诱导的血小板聚集有明显 的抑制作用（P < ο · ο5)，4mg/mL、2 · 3mg/mL和 1 · 33mg/mL抑制率分别为92 · 3 %、42 · 8 % 和 16.9% ;寡糖终浓度为2~5mg/mL对体外胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用（P< 0.05)，5mg/mL、3.5mg/mL和2mg/mL抑制率分别为79.5%、46·4%和31.7%，5mg/mL抑制率强 于阳性对照组抑制率72%。
【主权项】
1. 一种具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分，主要以疏血通注射液为原料，经提取精 制而得到，其特征在于所述的寡糖类组分是由大约2~10个左右单糖单元聚合而成的一系 列寡糖类组分，所述寡糖类组分通过如下步骤制备而成： a. 前处理:取疏血通注射液减压浓缩至一定体积； b. 醇沉:取浓缩液，加入一定量乙醇醇沉，低温静置，弃去上层含乙醇液体，取沉淀层； c .柱层析:取沉淀层加适量水溶解后，离心，取上清液通过分子筛排阻的凝胶过滤柱， 收集洗脱液，减压浓缩后，再通过预先活化的阴离子交换柱，收集洗脱液，浓缩，冻干即得。2. 根据权利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分，其特征在于:构成其寡 糖组分的单糖单元为葡萄糖、半乳糖、甘露糖，其中主要为葡萄糖。3. 根据权利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分，所述的抗血小板聚集 活性主要是对体外ADP诱导和胶原诱导的血小板聚集有明显的抑制作用。4. 根据权利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分，其特征在于，分子量范 围为 200Da ~3000Da。5. 根据权利要求1所述的具有抗血小板聚集活性的寡糖类组分，其特征在于，分子量范 围为 200Da ~2000Da。6. 根据权利要求1所述的寡糖类组分，其特征在于，所述步骤a中的减压浓缩温度为40 °C~70 °C，减压浓缩的最终体积为浓缩前体积的1 /2~1 /4。7. 根据权利要求6所述的寡糖类组分，其特征在于，所述步骤a中的减压浓缩温度为50 °C，减压浓缩的最终体积为浓缩前体积的1/3。8. 根据权利要求1所述的寡糖类组分，其特征在于，所述步骤b中的醇沉步骤，加入乙醇 后最终含醇量为70 %~80 %。9. 根据权利要求1所述的寡糖类组分，其特征在于，所述步骤c中的分子筛排阻的凝胶 过滤柱，主要是指是葡聚糖凝胶柱，所述凝胶柱的洗脱溶剂为水，洗脱液收集体积为1/3~1 的柱体积;所述阴离子交换柱，主要是指弱阴离子交换柱，所述阴离子交换柱的洗脱溶剂为 水，洗脱液收集体积为1~3柱体积。10. 根据权利要求9所述的寡糖类组分，其特征在于所述的凝胶柱为Sephadex G15、 Sephadex G25、Sephadex G50;所述阴离子交换柱为DEAE-52。11. 根据权利要求9所述的寡糖类组分，其特征在于所述的凝胶柱洗脱液收集体积为1/ 2柱体积，所述的阴离子交换柱洗脱液收集体积为2柱体积。
【文档编号】C07H1/06GK105949335SQ201610272887
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】李振国, 陈艳明, 周剑波, 夏珂
【申请人】牡丹江友搏药业股份有限公司