一种微生物测试片及其应用
【专利摘要】本发明公开了一种微生物测试片及其应用。本发明提供了一种微生物测试片，该微生物测试片包括覆膜、粘附有显色培养体系的粘附部件和位于二者之间的中层膜；所述粘附有显色培养体系的粘附部件包括粘附部件和粘附在其上的显色培养体系；所述显色培养体系由冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基组成；所述中层膜上设有通孔；所述中层膜的一个表面覆盖于所述显色培养体系上，且所述通孔与所述显色培养体系的位置相对应；所述覆膜覆盖所述中层膜的另一个表面。本发明的微生物测试片节省了操作人员清洗器皿、配制培养基、处置废弃物等工作，操作简便、随用随取，产品重复性好，准确性高。
【专利说明】
一种微生物测试片及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体属于微生物快速检测领域，尤其涉及一种微生物 测试片及其应用。
【背景技术】
[0002] 目前，我国微生物检测主要采用国标法，沿用传统的检测技术，如平板计数法，MPN 法以及生化鉴定等，这些方法需要检测者做大量的准备工作，包括刷洗器皿、配制培养基、 灭菌、处置废弃物等，不仅对仪器设备要求高，还对操作者的技能、经验有较高要求。由于检 测环节多，易污染，检测结果的准确性不易控制。
[0003] 测试片以其制作工艺简单，操作简便，结果准确，检测时间短等优点赢得了广大检 测人员的青睐。测试片不需要做实验前的准备工作，节省了劳动力。直接吸取样液滴加于测 试片上培养检测，省去生化鉴定环节，对操作者要求低，结果重复性好。
[0004] 目前涉及微生物检测的测试片主要有3种，滤纸测试片，无纺布测试片和凝胶测试 片。滤纸和无纺布基质的测试片制作简单，成本低，但这2种基质不透明，基质背面的菌落无 法计数，也无法挑取菌落做进一步鉴定。凝胶基质测试片可双面计数，并且可挑取菌落做后 续鉴定。3M测试片即为此类产品，但存在制作工艺繁琐，加样后样液易扩散至培养区外侧， 使检测结果偏低等缺点。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种微生物测试片。
[0006] 本发明提供的微生物测试片，该微生物测试片包括覆膜、粘附有显色培养体系的 粘附部件和位于二者之间的中层膜；
[0007] 所述粘附有显色培养体系的粘附部件包括粘附部件和粘附在其上的显色培养体 系；
[0008] 所述显色培养体系由冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基组成；
[0009] 所述中层膜上设有通孔；
[0010] 所述中层膜的一个表面覆盖于所述显色培养体系上，且所述通孔与所述显色培养 体系的位置相对应(即显色培养体系通过通孔暴露于外面，形成培养区。）；
[0011] 所述覆膜覆盖所述中层膜的另一个表面。
[0012] 上述粘附有显色培养体系的粘附部件按照包括如下步骤的方法制备:将冷水可溶 性凝胶和微生物显色培养基混合后，得到显色培养体系，再将所述显色培养体系粘附到所 述粘附部件的一侧表面，形成粘附有显色培养体系的粘附部件。
[0013] 上述测试片中，所述微生物显色培养基为平板计数显色培养基、VRB培养基、沙门 氏菌显色培养基、阪崎肠杆菌显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、乳酸菌显色培养 基、李斯特菌显色培养基或霉菌和酵母菌显色培养基；
[0014] 在本发明的实施例中，采用的微生物显色培养基为平板计数显色培养基，其由细 菌培养基和显色物TTC组成，所述显色物TTC和所述细菌培养基的质量比具体为0.05 :1。细 菌培养基由质量分数为58.8 %胰蛋白胨、质量分数为29.4 %酵母浸粉和质量分数为11.8 % 的葡萄糖组成。
[0015] 所述覆膜能覆盖所述通孔。
[0016] 所述覆膜的面积大于所述通孔的面积。
[0017] 上述微生物测试片中，所述微生物显色培养基和所述冷水可溶性凝胶的质量比为 1:卜3〇
[0018] 上述微生物测试片中，所述冷水可溶性凝胶为海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶或羟甲 基纤维素钠。
[0019] 上述微生物测试片中，所述中层膜的一个表面(为胶面)与所述显色培养体系粘合 连接；
[0020] 所述中层膜的另一个表面(为无胶面)的一侧边与所述覆膜的一侧边粘合连接，可 以通过聚丙烯酸压敏胶粘合。
[0021] 上述微生物测试片中，所述粘附部件为胶带;胶带的胶面的胶为聚丙烯酸压敏胶。 [0022]或，所述覆膜为防水薄膜。
[0023]或，所述中层膜与所述显色培养体系相接触的一个表面设有胶层，通过该胶层与 所述显色培养体系粘合连接。
[0024]或，所述中层膜为疏水片材。
[0025]或，所述防水薄膜的材质具体为PET、PVC或PE。
[0026]或，所述疏水片材具体为低密度聚苯乙烯发泡片材(密度18-22kg/m3,浙江华江科 技发展有限公司）。
[0027] 上述测试片中，所述通孔的直径为5 . Ocm-8. Ocm;所述胶带为7.0-10 . OcmX 8.0-11 .Ocm的长方形；
[0028] 所述疏水片材为7 · 0-10 · Ocm X 8 · 0-11 · Ocm的长方形。
[0029] 所述胶带、所述疏水片材和所述覆膜厚度为0.05mm-0.50mm。
[0030] 所述的覆膜宽度同疏水片材，长度长于疏水片材0 · 3cm-0 · 5cm〇
[0031] 上述的微生物测试片在检测微生物限度中的应用也是本发明保护的范围。
[0032] 上述的微生物测试片在微生物计数中的应用。
[0033] 本发明另一个目的是提供一种微生物计数的方法。
[0034] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0035] 1)揭起上述的微生物测试片的覆膜，再将待检微生物样液加在所述测试片的的中 层膜的通孔中，盖上所述覆膜，得到待检测测试片；
[0036]若待检样本(样液)未能均匀扩散，将测试片向没有样液一侧倾斜，或用手将样液 向没有样液一侧推送；
[0037] 3)将所述待检测测试片置于培养箱中培养，对培养后微生物进行计数。
[0038] 本发明的实验证明，本发明的微生物测试片节省了操作人员清洗器皿、配制培养 基、处置废弃物等工作，操作简便、随用随取，产品重复性好，准确性高。本发明克服了同类 产品的缺点，将显色培养基和凝胶直接混合后粘于胶带上，制作工艺简单，省去培养基加水 调配、涂布、烘干等环节，减少制作工艺对营养成分的破坏;上层直接为防水薄膜，省去粘附 冷凝胶步骤，测试片加样后扩散均匀，疏水片材形成的凹形培养区可有效防止样液扩散至 培养区外，结果更准确。
【附图说明】
[0039] 图1为微生物测试片的产品图。
[0040] 图2为微生物测试片的侧面效果图。
【具体实施方式】
[0041 ]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0042]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0043]实施例1、微生物测试片
[0044] 本发明的微生物测试片的结构示意图如图1和图2所示。
[0045] 本发明提供的微生物测试片，包括覆膜1、粘附有显色培养体系的胶带3和位于二 者之间的疏水片材2;疏水片材上设有通孔，疏水片材的一个表面覆盖于显色培养体系上， 且通孔与显色培养体系的位置相对应;覆膜覆盖疏水片材的另一个表面。疏水片材带有胶 的表面与胶带附有显色培养体系表面黏贴连接，胶带上的显色培养基从孔中露出；覆膜的 一边与疏水片材2的另一个表面的一侧边粘合连接。
[0046]粘附有显色培养体系的胶带为将冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基混合后，得 到显色培养体系，再将显色培养体系粘附到胶带的胶面，形成粘附有显色培养体系的胶带。 [0047]显色培养体系由微生物显色培养基和冷水可溶性凝胶组成，其中，微生物显色培 养基和冷水可溶性凝胶的质量比为1:1-3。
[0048]微生物显色培养基为平板计数显色培养基、VRB培养基、沙门氏菌显色培养基、阪 崎肠杆菌显色培养基、金黄色葡萄球菌显色培养基、乳酸菌显色培养基、李斯特菌显色培养 基或霉菌和酵母菌显色培养基。
[0049] 上述各实施例仅用于说明本发明，其中各部件的结构、设置位置及其连接方式等 都是可以有所变化的，凡是在本发明技术方案的基础上进行的等同变换和改进，均不应排 除在本发明的保护范围之外。
[0050] 实施例2、微生物菌落总数测试片制备及应用
[0051 ] -、微生物菌落总数测试片制备的制作
[0052] 1、粘附有显色培养体系的胶带的制备
[0053] 将2.00g海藻酸钠(河南德旺化工实业有限公司；货号:9005-38-3)和1.05g平板计 数显色培养基混合均匀，得到显色培养体系，再将显色培养体系粘附于胶带上，得到粘附有 显色培养体系的胶带。
[0054]上述平板计数显色培养基由1.00g细菌培养基和0.05g指示剂TTC(Sigma公司货号 T8877)混匀得到;细菌培养基由5.00g胰蛋白胨、2.50g酵母浸粉、1.00g葡萄糖组成，准确称 取后混合均匀，再从混合物中称取1 .〇〇g。
[0055] 2、设有通孔疏水片材制备
[0056]疏水片材为低密度发泡聚苯乙烯（密度18-22kg/m3,浙江华江科技发展有限公 司），且一面为胶面(胶为聚丙烯酸压敏胶），另一面无胶面。
[0057] 将上述疏水片材裁切成9.0cmX 10.0cm的长方形，中间裁切成直径6.5cm的圆形， 得到设有通孔疏水片材。
[0058] 3、测试片制备
[0059]将上述1制备的粘附有显色培养体系的胶带裁切成9 · 0cm X 10 · 0cm的长方形；
[0060]将覆膜(PVC防水薄膜)裁切成9 · 0cm X 10 · 5cm的长方形；
[0061] 将上述2制备设有通孔疏水片材的胶面粘贴在粘附有显色培养体系的胶带的培养 基面，再将上述覆膜与设有通孔疏水片材的无胶面在短边一侧以压敏胶粘合，粘合宽度 1·0cm〇
[0062] 铝箱袋包装封口后，环氧乙烷灭菌备用，得到微生物菌落总数测试片。
[0063]二、微生物菌落总数测试片的应用
[0064] 接种:分别取10份生鲜蔬菜样品，每份样品按无菌操作取25g于无菌均质袋中，加 入225mL无菌生理盐水，以拍击式均质器均质lmin，制成ΚΓ 1菌液，再吸取lmL加入到9mL无菌 生理盐水中，制成10-2菌液，以此做10倍梯度稀释。选2-3个适宜稀释度各吸取lmL滴加于培 养区，缓慢盖上上层覆膜，若样液未能均匀扩散，可将测试片向没有样液一侧倾斜，或用手 将样液向没有样液一侧推送，凝固lmin，每个稀释度2个重复，叠 放每摞不超过10片，36°C 土 1°(：培养4811±211。同时以平板倾注法作为对照，按684789.2-2010标准进行操作;吸取11^无 菌生理盐水作为空白对照，空白对照2个重复。
[0065] 计数:培养结束后计数红色菌落，以平均数在20-200个菌落的2个测试片平均值乘 以相应稀释度作为该样品菌落总数。空白对照菌落数为0,否则实验无效。平板倾注法按 684789.2-2010法进行计数。
[0066]统计：以测试片法和平板倾注法测得的各样品菌落总数做t-检验，以P<0.05存在 显著差异。
[0067]表1测试片法与平板倾注法检测10份生鲜蔬菜样品菌落总数结果
[0068] (单位：cfu/g)
[0069]
[0070] 注：1:西红柿；2:马铃薯；3:菠菜;4:山药;5:丝瓜;6:芸豆;7:绿豆芽;8:胡萝卜;9: 黄瓜;10:前子
[0071] 实验证明测试片法与平板倾注法检测10份生鲜蔬菜样品菌落总数无显著差异(P =0.339 > 0.05 )，可代替常规方法检验样品菌落总数。
[0072] 实施例3、大肠菌群测试片的制作及应用 [0073] 一、大肠菌群测试片的制作
[0074] 1、粘附有显色培养体系的胶带的制备
[0075] 将2.00g海藻酸钠(河南德旺化工实业有限公司；货号:9005-38-3)和1.05g微生物 显色培养基混合均匀，得到显色培养体系，将显色培养体系粘附于胶带上，得到粘附有显色 培养体系的胶带。
[0076] 上述微生物显色培养基由1. OOgVRB培养基和0.05g指示剂TTC(Sigma公司货号 T8877)混匀得到。VRB培养基由7.00g蛋白胨、3.00g酵母浸粉、5.00g氯化钠、10.00g乳糖、 1.50g胆盐、0.03g中性红组成，准确称取后混合均勾，再从混合物中准确称取1.00g。
[0077] 2、设有通孔疏水片材制备
[0078]疏水片材为低密度发泡聚苯乙烯（密度18_22kg/m3,浙江华江科技发展有限公 司），且一面为胶面(胶为聚丙烯酸压敏胶），另一面没有胶。
[0079] 将上述疏水片材裁切成9.OcmX 10.0cm的长方形，中间裁切成直径6.5cm的圆形， 得到设有通孔疏水片材。
[0080] 3、测试片制备
[0081 ]将上述1制备的粘附有显色培养体系的胶带裁切成9 · 0cm X 10 · 0cm的长方形；
[0082]将覆膜(PVC防水薄膜)裁切成9 · 0cm X 10 · 5cm的长方形；
[0083] 将上述2制备设有通孔疏水片材的胶面粘贴在粘附有显色培养体系的胶带的培养 基面，再将上述覆膜与设有通孔疏水片材的无胶面在短边一侧以压敏胶粘合，粘合宽度 1·0cm〇
[0084] 铝箱袋包装封口后，环氧乙烷灭菌备用，得到大肠菌群测试片。
[0085]二、大肠菌群测试片的应用
[0086]接种:分别取10份生鲜蔬菜样品，每份样品按无菌操作取25g于无菌均质袋中，加 入225mL无菌生理盐水，以拍击式均质器均质lmin，制成ΚΓ1菌液，再吸取lmL加入到9mL无菌 生理盐水中，制成10- 2菌液，以此做10倍梯度稀释。选2-3个适宜稀释度各吸取lmL滴加于培 养区，缓慢盖上上层覆膜，若样液未能均匀扩散，可将测试片向没有样液一侧倾斜，或用手 将样液向没有样液一侧推送，凝固lmin，每个稀释度2个重复，叠 放每摞不超过10片，36°C 土 1°C培养24h ± 2h。同时以MPN法作为对照，按GB4789.3-2010标准进行操作。
[0087]计数:培养结束后计数红点带泡菌落，以平均数在20-200个菌落的2个测试片平均 值乘以相应稀释度作为该样品大肠菌群数。MPN法按GB4789.3-2010标准进行计数。
[0088]统计：以测试片法和MPN法测得的各样品大肠菌群数做t-检验，以P<0.05存在显 著差异。
[0089]表2测试片法与MPN法检测10份生鲜蔬菜样品大肠菌群结果
[0090] (测试片单位:cfu/g，MPN法单位:MPN/g)
[0091]
[0092] 注：1:西红柿；2:马铃薯；3:菠菜;4:山药;5:丝瓜;6:芸豆;7:绿豆芽;8:胡萝卜;9: 黄瓜;10:前子
[0093]实验证明测试片法与MPN法检测10份生鲜蔬菜样品大肠菌群数无显著差异(P = 0.243>0.05)〇
【主权项】
1. 一种微生物测试片，该微生物测试片包括覆膜、粘附有显色培养体系的粘附部件和 位于二者之间的中层膜； 所述粘附有显色培养体系的粘附部件包括粘附部件和粘附在其上的显色培养体系； 所述显色培养体系由冷水可溶性凝胶和微生物显色培养基组成； 所述中层膜上设有通孔； 所述中层膜的一个表面覆盖于所述显色培养体系上； 所述覆膜覆盖所述中层膜的另一个表面。2. 根据权利要求1所述的微生物测试片，其特征在于:所述微生物显色培养基和所述冷 水可溶性凝胶的质量比为1:1-3。3. 根据权利要求2所述的微生物测试片，其特征在于： 所述冷水可溶性凝胶为海藻酸钠、黄原胶、瓜尔豆胶或羟甲基纤维素钠。4. 根据权利要求1-3中任一所述的微生物测试片，其特征在于： 所述中层膜的一个表面与所述显色培养体系粘合连接； 所述中层膜的另一个表面的一侧边与所述覆膜的一侧边粘合连接。5. 根据权利要求1-4中任一所述的微生物测试片，其特征在于： 所述粘附部件为胶带； 或，所述覆膜为防水薄膜； 或，所述中层膜与所述显色培养体系相接触的一面设有胶层，通过该胶层与所述显色 培养体系粘合连接； 或，所述中层膜为疏水片材。6. 根据权利要求5所述的微生物测试片，其特征在于： 所述防水薄膜的材质为PET、PVC或PE。 或，所述疏水片材为低密度聚苯乙烯发泡片材。7. 权利要求1-6任一所述的微生物测试片在检测微生物限度中的应用。8. 权利要求1-6任一所述的微生物测试片在微生物计数中的应用。9. 一种微生物计数的方法，包括如下步骤： 1)揭起权利要求1-6中任一所述的微生物测试片的覆膜，再将待检微生物样液加在所 述测试片的中层膜的通孔中，，盖上所述覆膜，得到待检测测试片； 3)将所述待检测测试片置于培养箱中培养，对培养后微生物进行计数。
【文档编号】C12M1/34GK105950459SQ201610554674
【公开日】2016年9月21日
【申请日】2016年7月14日
【发明人】孙百莉, 迟俊
【申请人】孙百莉